基于iPS細(xì)胞和納米纖維支架的組織工程心肌構(gòu)建研究.pdf

1、背景：心血管疾病是全球范圍導(dǎo)致人類(lèi)死亡的首要病因，近些年來(lái)每年全球范圍內(nèi)因心血管疾病死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的比例均超過(guò)30％，已經(jīng)造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心肌梗死是最常見(jiàn)的心血管疾病類(lèi)型，在人群中具有很高的發(fā)病率和死亡率。心肌梗死導(dǎo)致心臟永久性損失數(shù)以億計(jì)的功能心肌細(xì)胞，這些壞死損失的心肌細(xì)胞逐漸被成纖維細(xì)胞所形成的瘢痕組織替代，心臟隨之發(fā)生重構(gòu)，存活的患者最終將發(fā)展為心力衰竭直至死亡。
　　人類(lèi)心臟再生能力極為有限，一旦發(fā)生心

2、肌梗死，功能心肌細(xì)胞的損失將無(wú)法得到彌補(bǔ)。當(dāng)前所有的治療方法和策略均只為補(bǔ)救性措施，比如藥物治療、冠脈介入手術(shù)治療、以及外科搭橋手術(shù)治療，雖然可以有效延緩疾病的發(fā)展，但它們均無(wú)法完全恢復(fù)心臟的功能或是逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)。全心移植是重癥心肌梗死患者目前唯一最有效的根治性治療選擇。在過(guò)去的十多年中，干細(xì)胞生物學(xué)方面的重大突破使得我們已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)心肌細(xì)胞的再生，使得為這類(lèi)疾病患者提供再生心臟的美好愿望成為可能。然而，當(dāng)前基于干細(xì)胞的移植再生療法仍然

3、存在諸如細(xì)胞存活差、細(xì)胞滯留低、無(wú)法形成功能性心肌組織等難題，尚難以取得滿意療效。因此體外構(gòu)建出可供移植的組織工程心肌移植體就成為了當(dāng)前新的選擇。
　　目的：利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與納米纖維支架構(gòu)建較為成熟、具有機(jī)械/電偶聯(lián)的一體化組織工程心肌移植物。
　　方法：
　　1)分別采用擬胚體法和單層貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行鼠源Oct4-GFP+ iPSC（induced pluripotent stem cell）培養(yǎng)分化，并進(jìn)行心肌細(xì)

4、胞標(biāo)志物免疫染色，明確該iPSC細(xì)胞系向心肌細(xì)胞分化的可行性。
　　2)添加抗壞血酸素（Ascorbic acid,AA）作為心肌分化誘導(dǎo)劑，觀察、計(jì)數(shù)跳動(dòng)EB的數(shù)量，借以評(píng)估抗壞血酸素的心肌分化誘導(dǎo)作用。
　　3)采用靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)聚己內(nèi)酯（Poly-(ε-caprolactone), PCL）和聚己內(nèi)酯/明膠（PCL/Gelatin）復(fù)合納米纖維支架，用于iPSC的心肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，明確支架平臺(tái)可否適用于組織工程心肌構(gòu)

5、建。
　　4)觀察支架對(duì)iPSC心肌方向分化的作用，并探討支架微觀形貌對(duì)于心肌分化的影響及可能的信號(hào)機(jī)制。
　　5)采用單層法聯(lián)合多種分化誘導(dǎo)劑進(jìn)一步提高心肌分化效率，獲取大批量高純度心肌細(xì)胞。
　　6)利用納米纖維支架進(jìn)行iPSC源心肌細(xì)胞的成熟化培養(yǎng)，并進(jìn)行成熟化指標(biāo)評(píng)價(jià)。
　　7)采用單層法聯(lián)合多種分化誘導(dǎo)劑在納米纖維支架上培養(yǎng)構(gòu)建具有自主節(jié)律、能夠同步收縮/舒張活動(dòng)的組織工程心肌。
　　結(jié)果：

6、>　　1)采用懸滴法制得大小均一的擬胚體細(xì)胞團(tuán)，能夠自發(fā)分化出少量跳動(dòng)的擬胚體；添加抗壞血酸素能夠顯著升高跳動(dòng)擬胚體的比例，有效促進(jìn)心肌分化；單層貼壁法同樣也可以誘導(dǎo)我們的iPSC細(xì)胞系分化出心肌細(xì)胞，免疫染色結(jié)果證實(shí)cTnI陽(yáng)性細(xì)胞存在。證明該iPSC細(xì)胞具備心肌分化能力，可用于后續(xù)心肌組織構(gòu)建。
　　2)靜電紡絲技術(shù)成功制得纖維直徑為納米級(jí)別的PCL和PCL/Gelatin復(fù)合支架，具備與細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi)似的多孔隙三維立體結(jié)構(gòu)；支

7、架用于iPSC的培養(yǎng)分化能夠獲得cTnT陽(yáng)性、MLC2a陽(yáng)性的心肌細(xì)胞，而且動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜及心肌特異性蛋白質(zhì)表達(dá)譜，均證實(shí)心肌細(xì)胞存在。證實(shí)這種納米纖維支架平臺(tái)適用于iPSC的心肌分化培養(yǎng)。
　　3)同等分化條件下采用納米纖維支架具有比培養(yǎng)皿更強(qiáng)的促iPSC心肌細(xì)胞分化作用，我們認(rèn)為這一作用與納米纖維支架的微觀形貌有關(guān)。進(jìn)一步調(diào)控經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，證實(shí)其參與了這一促分化作用。
　　4)三維納米纖維支架聯(lián)合多種促心肌細(xì)胞分化

8、因子，能夠促進(jìn)iPSC在支架上高效向心肌細(xì)胞分化。
　　5)支架上分化獲得的心肌細(xì)胞在肌節(jié)結(jié)構(gòu)、心肌特異性蛋白MLC2v的表達(dá)方面顯著強(qiáng)于培養(yǎng)皿對(duì)照，提示納米纖維支架能夠有效促進(jìn)分化心肌細(xì)胞的成熟。
　　6)通過(guò)綜合運(yùn)用分化誘導(dǎo)因子、納米纖維支架和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間等措施，成功促使心肌細(xì)胞肌節(jié)發(fā)育更為完善、電鏡下結(jié)構(gòu)更為清晰、蛋白表達(dá)譜也更為成熟。
　　7)利用支架作為培養(yǎng)載體，成功培養(yǎng)出具有自主節(jié)律、同步收縮/舒張的成熟心