仿生髓核組織工程細(xì)胞支架的構(gòu)建和性能研究.pdf

1、下腰痛是現(xiàn)代社會(huì)中一種常見病和多發(fā)病，是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要原因之一。腰椎間盤突出癥等椎間盤退行性疾病是引起下腰痛最常見原因。伴隨人體的老化，椎間盤也相應(yīng)發(fā)生退行性改變，如何延緩和降低椎間盤退變的速率，以及研究開發(fā)符合椎間盤包括髓核結(jié)構(gòu)與功能的移植物，對(duì)退變椎間盤進(jìn)行功能重建，已成為治療椎間盤退行性疾病比較理想的解決方案。 近年來組織工程學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，為體外構(gòu)建理想的椎間盤組織創(chuàng)造了極其有利的條件并提供了可能。然而采用組織工

2、程學(xué)技術(shù)構(gòu)建椎間盤的研究目前國外尚處于起步階段，國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。文獻(xiàn)報(bào)道中應(yīng)用于組織工程化髓核的細(xì)胞支架基本來源于骨或軟骨組織工程的生物材料，使用的均為Ⅰ型膠原或其它如聚羥基乙酸、藻酸鈣鹽、瓊脂糖凝膠、殼聚糖、纖維蛋白等生物大分子。雖然這些支架材料均有較好的生物相容性，而生理?xiàng)l件下髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原成分為Ⅱ型膠原，由于上述這些生物大分子與CⅡ相比，存在著結(jié)構(gòu)和親水性差異，因此不能復(fù)制出正常髓核的半凝膠狀態(tài)，在結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)上

3、存在著巨大的差異。并且這些支架材料不能提供髓核細(xì)胞外基質(zhì)與髓核細(xì)胞間的信息交流，從而不能真正作為髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)的替代物。因此探索構(gòu)建理想的細(xì)胞支架，成為組織工程化髓核研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。 本課題旨在以生理?xiàng)l件下髓核細(xì)胞外基質(zhì)主要成份：CⅡ、HyA和6-CS為原料，探索實(shí)驗(yàn)條件，抑制PIC形成，從而構(gòu)建適用于髓核組織工程的仿生髓核細(xì)胞支架，并對(duì)其性能進(jìn)行研究分析，探討其可行性，以用于組織工程化髓核的實(shí)驗(yàn)研究。共包括四部分實(shí)驗(yàn)

4、內(nèi)容。 第一部分、仿生髓核組織工程支架材料的構(gòu)建及其結(jié)構(gòu)分析。以CⅡ、HyA和6-CS為原料，采用冷凍干燥技術(shù)，并結(jié)合化學(xué)交聯(lián)技術(shù)構(gòu)建仿生髓核組織工程細(xì)胞支架一CⅡ/HyA-CS支架(命名為CHCS支架)，并對(duì)其GAG含量及成分、孔徑大小、孔隙率、含水能力、體外膠原酶降解能力、熱變性溫度、彈性模量等進(jìn)行分析。 第二部分、CHCS支架的免疫原性研究。通過大鼠皮下包埋實(shí)驗(yàn)，觀測在體組織的炎性反應(yīng)及改建過程，RT-PCR檢測組

5、織內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)和ELISA法檢測血清中抗豬CⅡ抗體水平。 第三部分、CHCS支架的細(xì)胞相容性研究。將體外單層培養(yǎng)的髓核細(xì)胞接種放有CHCS支架的培養(yǎng)板內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)。通過觀測髓核細(xì)胞的DNA含量、3H-脯氨酸攝入量、以及蛋白聚糖，包括可聚蛋白多糖(aggrecan)、二聚糖(biglycan)和核聚糖(decorin)mRNA以及aggrecan蛋白表達(dá)等變化，以評(píng)定CHCS支架的細(xì)胞相容性。 第

6、四部分、CHCS支架的在體組織性能研究。以單層培養(yǎng)的傳1代髓核細(xì)胞為種子細(xì)胞，體外初步構(gòu)建組織工程化髓核，并植入摘除髓核的椎間盤內(nèi)，觀察椎間隙的高度、相應(yīng)節(jié)段生物力學(xué)性能以及組織學(xué)改變。 主要結(jié)果及結(jié)論如下：1.用冷凍干燥和化學(xué)交聯(lián)技術(shù)，成功構(gòu)建了以髓核細(xì)胞外基質(zhì)主要成分：CⅡ、HyA、CS為主要成分的CHCS髓核組織工程支架材料； 2.所構(gòu)建的CHCS支架材料為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有相互溝通的孔隙，其孔徑為89～132nm

7、，孔隙率達(dá)到94.8％，含水能力為79.2％。并具有較高的抵抗熱變性能力和膠原酶降解能力以及一定的彈性模量，初步顯示出CHCS支架材料具有良好的結(jié)構(gòu)性能； 3.所構(gòu)建的CHCS支架植入大鼠皮下后，未引發(fā)明顯的炎性細(xì)胞浸潤和抗CⅡ抗體的產(chǎn)生，顯示出CHCS支架具有極低的免疫原性； 4.所構(gòu)建的CHCS支架材料對(duì)體外分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞的生長、增殖及代謝無明顯抑制作用，并且髓核細(xì)胞能在其表面及內(nèi)部黏附、生長和增殖，初步顯示出CH