枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵條件優(yōu)化及相關(guān)改造.pdf

1、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）具有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)分泌能力，是十分重要的工業(yè)酶制劑生產(chǎn)菌種。大量來源于不同生物的外源基因已經(jīng)在B.subtilis中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，但分泌量低下這一瓶頸仍未得到解決。為了拓展B.subtilis在異源蛋白分泌生產(chǎn)中的應(yīng)用，本論文從定點(diǎn)突變、發(fā)酵條件優(yōu)化以及底盤細(xì)胞改造等幾個(gè)方而入手以期提高異源蛋白分泌效率。
　　兩種蛋白產(chǎn)品α-淀粉酶（AmyL和AmyS）和D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)

2、酶(DPE)的編碼基因amyl、amys和rdpe分別來自Bacillus licheniformis、Bacillusste arothermophilus和Ruminococcus sp.（瘤胃球菌屬）。三種基因在B.subtilis中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。以AmyL為例進(jìn)行了定向進(jìn)化研究，尤其經(jīng)過H133YA209V雙突變后效果明顯，其耐酸性與耐熱性均有所改善。其最適pH值降到6.0～6.5，在pH值5.0時(shí)，相對酶活達(dá)到將近80％;其

3、最適溫度提高到100℃，在90℃保溫2h后，剩余酶活達(dá)到93％，甚至在100℃保溫1h后仍有酶活顯示(6％)。
　　微生物的生長發(fā)酵環(huán)境是其表達(dá)和分泌目標(biāo)蛋白的重要影響因子，通過對α-淀粉酶搖瓶發(fā)酵的優(yōu)化，得出發(fā)酵α-淀粉酶的最適碳源為淀粉，最適氮源為蛋白胨，最適溫度為37℃，最適初始pH值為7.0。搖瓶中最高酶活能達(dá)到571 U/mL。通過對α-淀粉酶的發(fā)酵罐發(fā)酵優(yōu)化，得出其最適發(fā)酵條件為溶氧維持30％～40％，溫度維持37℃，

4、pH值維持7.0，采取流加補(bǔ)料方式進(jìn)行補(bǔ)料。在最適發(fā)酵條件下分別對菌株1A751L和1A751S進(jìn)行發(fā)酵，在72 h時(shí)酶活達(dá)到最高值，分別為810 U/mL和2812 U/mL，分別比搖瓶中提高40％和100.8％。
　　稀少糖類都具有廣泛的功能和應(yīng)用前景。因?yàn)樗鼈冇性S多的優(yōu)點(diǎn)，諸如熱量低，吸收低等。在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域均有著重要的功能作用。利用DTEase家族酶來生產(chǎn)高濃度的D-阿洛酮糖是可行的。
　　本研究通過對發(fā)酵

5、條件的優(yōu)化，找到一種基于調(diào)節(jié)pH值的分段式發(fā)酵策略。通過菌體生長與蛋白表達(dá)分段式的培養(yǎng)發(fā)酵方法，實(shí)現(xiàn)了RDPE在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)和分泌。在7.5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵72h，RDPE酶活達(dá)到74U/mL，其蛋白產(chǎn)量在發(fā)酵液中達(dá)到了2.2 g/L。為以果糖為原料通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供重要作用。
　　芽孢桿菌類在生長后期會(huì)有自溶裂解現(xiàn)象產(chǎn)生，這會(huì)釋放出大量的副產(chǎn)物到培養(yǎng)基中，甚至影響目標(biāo)蛋白的表達(dá)，以及后續(xù)