構(gòu)巢曲霉β-1，3-葡聚糖酶ENGA的異源重組表達(dá)、鑒定及生理功能研究.pdf

1、真菌細(xì)胞壁是位于真菌原生質(zhì)體外的一種剛性結(jié)構(gòu)，在真菌的生理活動(dòng)中起到重要的作用。真菌細(xì)胞壁中含有大量的葡聚糖和幾丁質(zhì)，構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架。在真菌部分生理活動(dòng)中，如絲狀真菌菌絲分支或酵母的出芽和分裂過(guò)程中，內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶可能通過(guò)水解作用維持細(xì)胞壁的可塑性。此外，真菌內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶還參與胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用及細(xì)胞壁的自溶過(guò)程。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，灰蓋鬼傘的葡聚糖內(nèi)切酶ENG1參與細(xì)胞壁的重構(gòu)，本研究以子囊屬真菌

2、構(gòu)巢曲霉為研究材料，在數(shù)據(jù)庫(kù)中查到構(gòu)巢曲霉GH16家族共有10個(gè)基因。本研究希望利用重組表達(dá)研究上述葡聚糖內(nèi)切酶的酶學(xué)性質(zhì)，最終成功的重組表達(dá)一個(gè)具有水解活性的β-1，3-葡聚糖酶蛋白(AN0245)，并對(duì)它的酶學(xué)性質(zhì)及生理功能展開(kāi)了研究。
　　本研究以甲醇誘導(dǎo)型的畢赤酵母為宿主細(xì)胞，對(duì)構(gòu)巢曲霉GH16中的內(nèi)切-β-1，3(4)-葡聚糖酶ENGA進(jìn)行異源重組表達(dá)。重組表達(dá)菌株在30℃培養(yǎng)條件下以每24 h添加終濃度為0.5％的甲醇

3、進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，可在胞外表達(dá)出有活性的蛋白，將粗酶液用Ni-柱純化后獲得大量含高活性的ENGA蛋白，SDS-PAGE顯示ENGA的分子量大小為37 KDa。對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，其最適反應(yīng)溫度為60℃和最適pH為pH5.5，具有較寬的溫度穩(wěn)定性(20-70℃)和pH穩(wěn)定性(4.0-9.0)，HPAEC分析顯示ENGA具有β-1，3-葡聚糖內(nèi)切水解酶活性和轉(zhuǎn)糖基活性，在以昆布多糖為底物時(shí)，動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax分別為30 mg/mL，