陽離子抗菌肽G13的原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、顆粒裂解肽(Granulysin)是陽離子抗菌肽的一種，來自細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。陽離子抗菌肽G13是Granulysin中，含19個(gè)氨基酸殘基肽段，含有α-螺旋結(jié)構(gòu)及l(fā)oop結(jié)構(gòu)，對細(xì)菌具有抑菌活性而對動物細(xì)胞無毒，具有重要的研究價(jià)值?？咕脑吮磉_(dá)主要采用融合表達(dá)技術(shù)抑制抗菌肽的毒性。但融合頭一般在重組蛋白中比例較高，導(dǎo)致了抗菌肽的實(shí)際表達(dá)產(chǎn)量較低。本實(shí)驗(yàn)以pThiohisA-G13載體中的融合頭為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了一對反向引

2、物，采用反向PCR方法去除載體了融合頭中87個(gè)氨基酸殘基，構(gòu)建了pThiohisA-G13-A質(zhì)粒，同時(shí)獲得了高效表達(dá)，將抗菌肽的實(shí)際產(chǎn)量提高了2.3倍，具有廣泛的應(yīng)用前景。融合頭切割一直是抗菌肽融合表達(dá)的一個(gè)突出問題。傳統(tǒng)的酶法成本極高，化學(xué)法中，溴化氰含有劇毒，難以廣泛使用。
　　本實(shí)驗(yàn)利用天冬氨酸-脯氨酸之間的肽鍵在低PH下不穩(wěn)定的特性，在融合頭與抗菌肽之間添加酸水解切割位點(diǎn)，構(gòu)建了pThiohisA-G13-C質(zhì)粒，獲得了

3、重組蛋白的可溶性表達(dá)。同時(shí)研究了酸水解反應(yīng)條件，成功地切割了陽離子抗菌肽G13結(jié)構(gòu)域，并通過陽離子交換獲得了純化的陽離子抗菌肽G13結(jié)構(gòu)域，瓊脂糖擴(kuò)散法檢測了重組陽離子抗菌肽G13對大腸桿菌DH5α抑菌活性。為抗菌肽在低成本大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對抗菌肽真核表達(dá)進(jìn)行了研究，成功地對陽離子抗菌肽G13在釀酒酵母中的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了具有活性的陽離子抗菌肽G13，從而建立了一套穩(wěn)定表達(dá)的方法。為后續(xù)的純化和類似抗菌