奶牛子宮內(nèi)膜抗菌肽分離純化、BNBD5基因的克隆及原核表達.pdf

1、內(nèi)源性抗微生物肽是生物體內(nèi)先天性免疫的重要組成部分，防御素是廣泛分布于動物和植物界的一類富含半胱氨酸的陽離子內(nèi)源性抗微生物肽，是內(nèi)源性抗微生物肽中的一個大家族。是由生物細胞特定基因編碼，經(jīng)特定外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類多肽。具有抵抗外界微生物侵害、消除體內(nèi)突變細胞的作用。根據(jù)防御素分子內(nèi)半胱氨酸的位置和連接方式、前體性質(zhì)及表達位置的差異可分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆蟲防御素和植物防御素五種類型，防御素主要分布于哺乳動物的黏膜上

2、皮細胞內(nèi)，所以，防御素被確認為黏膜表面抗微生物屏障的組成成分。 在實驗中以奶牛子宮為實驗材料，從奶牛子宮內(nèi)膜上皮組織中提取總RNA，根據(jù)已發(fā)表的牛抗菌肽基因序列設(shè)計引物。經(jīng)RT-PCR擴增抗菌肽DNA片段，回收純化PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a。在含X-Gal、Amp及IPTG的LB平板上篩選陽性克隆，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定后，對目的片段進行測序。結(jié)果表明，RT-PCR擴增出的cDNA片段堿基數(shù)為138

3、bp，編碼45個氨基酸的多肽，多肽中含6個保守半胱氨酸殘基。用Blast程序進行檢索比較，表明擴增序列與GenBank中發(fā)表的BNBD5編碼區(qū)序列99．3%相同。利用DNAStar MegAlign分析了奶牛子宮內(nèi)膜抗菌肽BNBD5與其他物種β-防御素5的ORF序列，得出奶牛BNBD5的cDNA與其他動物的β-防御素5的同源性。與山羊（Capra hircus，DQ532360）有80．4%的同源性，與小鼠（Mus musculus，N

4、M_030734）有56．5%的同源性，與褐鼠（Rattus norvegicus，NM_001037549）有31．9%的同源性，而與岡比亞按蚊（Anopheles gambiae，EU273600）、中華蜜蜂（Apis cerana cerana，EU727272）和原雞（Gallus gallus，AY621320、AY621307、DQ677636）的同源性均低于20%。這說明反芻動物的β防御素cDNA具有種屬特異性。

5、再以重組質(zhì)粒為模板，用特異性表達引物擴增得到的基因：即編碼BNBD5基因全長cDNA連接到原核表達載體pET28a中，構(gòu)建的原核表達質(zhì)粒pET-BNBD5，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了pET28a-BNBD5載體，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，pET28a-BNBD5在原核內(nèi)表達產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約為10ku，與預(yù)期融合蛋白大小一致，并以包涵體的形式存在，瓊脂擴散實驗檢測表達產(chǎn)物的體外抑菌活性，在大腸桿菌中表達的奶牛子宮內(nèi)膜抗

6、菌肽的體外抑菌活性不太明顯。 本實驗再以奶牛子宮為實驗材料，刮取內(nèi)膜上皮，用5%的冰乙酸抽提，通過酸性尿素聚丙烯酰胺電泳洗脫技術(shù)和反相高效液相色譜技術(shù)，分離純化奶牛子宮黏液內(nèi)源性抗菌肽，并進行其抗菌活性的檢測?；钚詸z測結(jié)果表明：在5min收集的樣品沒有抑菌圈出現(xiàn)，在45min收集的樣品具有抗大腸桿菌BL21和金黃色葡萄球菌26003的活性。 奶牛子宮內(nèi)膜防御素的發(fā)現(xiàn)有利于對奶牛黏膜的防御機制進行進一步的研究，從而為奶牛子