等位基因特異性PCR檢測HIV-1 CRF_01AE亞型耐藥突變方法的建立.pdf

1、目的:
　　根據(jù)等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR，ASPCR)原理設(shè)計引物，檢測廣西HIV-1 CRF01 AE亞型pol基因逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)主要耐藥突變，探索利用ASPCR法檢測艾滋病耐藥位點的可行性，為臨床耐藥檢測和耐藥流行病學(xué)調(diào)查提供快速、靈敏、高效、低成本的檢測技術(shù)。
　　方法:
　　利用不含耐藥突變HIV-1 CRF01_AE亞型pol基因片段和pUCm-T載體，構(gòu)建HIV-1 CRF0

2、1_AE亞型pol基因野生型質(zhì)粒。對所構(gòu)建的野生型克隆質(zhì)粒進(jìn)行定點突變，獲得含耐藥突變位點的突變型質(zhì)粒。根據(jù)ASPCR原理，設(shè)計通用下游引物以及針對每一突變位點的特異性上游引物，包含野生型檢測引物和突變型檢測引物。以構(gòu)建的野生型質(zhì)粒和各種突變型質(zhì)粒為模板，使用PCR法評價所設(shè)計的引物，篩選出特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物。選取少量艾滋病HARRT治療患者，同時使用直接測序法和ASPCR法檢測耐藥突變，通過比較驗證引物的有效性。
　　結(jié)果

3、:
　　1.成功構(gòu)建含HIV CRF01_AE亞型pol基因的PUCm-T質(zhì)粒，包括不含耐藥突變的野生型質(zhì)粒和19個含逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變位點的突變型質(zhì)粒，所有克隆經(jīng)過測序鑒定;
　　2.針對逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)19個位點，設(shè)計了一條通用下游引物以及每一位點的野生型引物和突變型引物各兩條。19個突變位點包括NRTIs耐藥突變10個，分別為M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y、T

4、215F; NNRTIs耐藥突變9個，分別是K103N、V108I、E138A、V179D、 Y181C、 Y188C、 G190A、G190R、M230I;
　　3.在19個耐藥位點中，有15個位點分別篩選出一條特異性良好的野生型引物，其中，M184V位點和M184I位點、G190R位點和G190A位點、T215Y位點和T215F位點的野生型引物相同。有16個位點分別篩選出一條靈敏度高的突變型引物，其中3個位點的檢測靈敏度達(dá)1％

5、突變樣本，9個位點的檢測靈敏度達(dá)5％突變樣本，4個位點的檢測靈敏度達(dá)10％突變樣本;
　　4.23例臨床樣本中，采用直接測序法檢出6例K103N突變、9例Y181C突變和5例G190A突變。采用本項目建立的ASPCR法檢出4例K103N突變、7例Y181C突變和5例G190A突變，與測序法的一致性分別為66.6％、77.8％和100％。
　　結(jié)論:
　　本研究探索了基于ASPCR原理建立HIV-1耐藥突變檢測方法，成功