MUC1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:本課題采用MUC1表達(dá)陰性的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染，獲得穩(wěn)定表達(dá)MUC1的HCT116細(xì)胞株，觀察MUC1對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲及化療敏感性的影響，為以MUC1為靶點(diǎn)的結(jié)腸癌治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)MUC1的HCT116細(xì)胞株：
　　(1) MUC1慢病毒載體的構(gòu)建：通過(guò)Genebank查詢?nèi)薓UC1基因，選取恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒，PCR擴(kuò)增目的基因，將目的基因與慢病毒質(zhì)粒雙酶切后

2、構(gòu)建重組質(zhì)粒并鑒定，之后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，并測(cè)定病毒滴度。
　　(2)慢病毒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　(3)采用半定量RT-PCR、Western Blot進(jìn)行MUC1表達(dá)的鑒定。
　　2. MUC1對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：
　　(1)實(shí)驗(yàn)分組：MUC1病毒組和空病毒組。
　　(2) CCK實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的增殖能力。
　　(3) Tra

3、nswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的侵襲能力。
　　3. MUC1對(duì)奧沙利鉑敏感性的影響：MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)奧沙鉑處理后兩組細(xì)胞凋亡率，酶底物法檢測(cè)奧沙利鉑處理后兩組細(xì)胞Caspase-3活性水平。
　　結(jié)果:
　　1.獲得穩(wěn)定表達(dá)MUC1的HCT116細(xì)胞株。
　　2.兩組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)無(wú)差異。MUC1病毒組細(xì)胞軟克隆形成數(shù)與空病毒組相比有明顯差異［(26.0±2.31) vs

4、(5.67±1.45)（P<0.05）］。
　　3. MUC1病毒組穿過(guò)小室纖維素膜的細(xì)胞數(shù)與空病毒組相比有明顯差異［(27.3±4.41) vs(81.0±8.14)（P<0.05）］。
　　4.兩組細(xì)胞奧沙利鉑作用24h后 IC50分別為：空病毒組 IC50（14.27±0.25）ug/mL，MUC1病毒組IC50（26.03±0.20）ug/mL。奧沙利鉑（5ug/mL）處理細(xì)胞36h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞的凋亡，

5、凋亡率分別為(26.6±1.22)，(18.5±1.44)（P<0.05）；奧沙利鉑（5ug/mL）處理細(xì)胞36h后，酶底物反應(yīng)法檢測(cè)兩組細(xì)胞Caspase-3活性，兩組細(xì)胞Caspase-3(U)分別為:(16.56±0.73)，(7.110±0.49)（P<0.05）。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)染 MUC1后細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成能力明顯增高、侵襲能力增強(qiáng)以及對(duì)奧沙利鉑的化療敏感性降低。初步探討MUC1耐藥機(jī)制發(fā)現(xiàn)可能與Caspase-3活