內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)非酒精性脂肪肝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：1.通過(guò)建立非酒精性脂肪肝（NAFLD）體內(nèi)外模型，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）對(duì) NAFLD的影響及機(jī)制。2.以雷公藤紅素干預(yù) NAFLD細(xì)胞模型，探討雷公藤紅素對(duì)NAFLD的防治作用，以及對(duì)其ERS的影響及可能機(jī)制。
　　方法：1. NAFLD體內(nèi)外模型的建立與鑒定：20只SD雄性大鼠以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）和非酒精性脂肪肝組（NAFLD），分別予以基礎(chǔ)飼料及高脂飼料喂養(yǎng)。LO2細(xì)胞分為c

2、ontrol組和NAFLD組，分別用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含0.2mmol/L軟脂酸培養(yǎng)基培養(yǎng)。HE染色觀察肝組織的形態(tài)學(xué)改變；油紅O染色分別觀察肝組織和LO2細(xì)胞脂肪蓄積情況；膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）試劑盒分別檢測(cè)肝組織和LO2細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量。2.免疫組織化學(xué)觀測(cè)肝組織GRP78蛋白的表達(dá)水平；PCR和Western-blot分別檢測(cè)NAFLD細(xì)胞模型中ERS相關(guān)信號(hào)分子ATF6、GRP78、IRE1、SCAP、SREBP-1c和

3、SREBP-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平。3.雷公藤紅素干預(yù)實(shí)驗(yàn)：將L02細(xì)胞分為control組、NAFLD組、雷公藤紅素低劑量組（Cel0.5）、雷公藤紅素高劑量組（Cel1）和辛伐他汀組（SIMVA）。油紅O染色觀察雷公藤紅素干預(yù)后LO2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況； TC和TG試劑盒分別檢測(cè)LO2細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量； PCR和Western-blot分別檢測(cè)雷公藤紅素作用下LO2細(xì)胞中ERS相關(guān)信號(hào)分子ATF6、GRP78、IRE1、SC

4、AP、SREBP-1c和SREBP-2的 mRNA以及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.NAFLD體內(nèi)外模型的建立與鑒定：HE染色顯示Control組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常；而NAFLD組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)大量脂滴空泡。肝組織和LO2細(xì)胞油紅O染色均顯示Control組紅染顆粒少，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，且排列整齊；而NAFLD組肝細(xì)胞內(nèi)含有大量紅染顆粒且發(fā)生脂肪變性。Control組肝組織和LO2細(xì)胞內(nèi)的TC和TG含量均低于NAFLD組（

5、P<0.05）。2.免疫組化結(jié)果顯示NAFLD組大鼠肝組織 GRP78蛋白表達(dá)水平高于 Control組（P<0.05）; PCR和Western-blot結(jié)果顯示NAFLD組LO2細(xì)胞內(nèi)UPR相關(guān)信號(hào)分子ATF6， GRP78和IRE1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于Control組（P<0.05）；NAFLD組LO2細(xì)胞內(nèi)固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)信號(hào)分子SCAP，SREBP-1c和SREBP-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于Control

6、組（P<0.05）。3.雷公藤紅素干預(yù)實(shí)驗(yàn)：油紅O染色顯示NAFLD組LO2細(xì)胞內(nèi)含有大量紅染顆粒，而 Cel0.5μg/ml組、Cel1μg/ml組及 SIMVA組紅染顆粒較NAFLD組有不同程度減少。NAFLD組LO2細(xì)胞TC及TG含量均高于Control組（P<0.05），Cel0.5μg/ml組、Cel1μg/ml組及SIMVA組LO2細(xì)胞TC及TG含量均較NAFLD組有不同程度減少（P<0.05）。PCR和Western-bl

7、ot結(jié)果顯示：（1）NAFLD組LO2細(xì)胞內(nèi)UPR相關(guān)信號(hào)分子ATF6， GRP78和 IRE1的 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于 Control組（P<0.05）；Cel1μg/ml組和SIMVA組LO2細(xì)胞內(nèi)ATF6，GRP78和IRE1的 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于 NAFLD組（P<0.05）。（2）NAFLD組 LO2細(xì)胞內(nèi)固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)信號(hào)分子 SCAP， SREBP-1c和SREBP-2的 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高

8、于 Control組（P<0.05）；Cel0.5μg/ml、Cel1μg/ml組和 SIMVA組 LO2細(xì)胞內(nèi) SCAP，SREBP-1c和SREBP-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于NAFLD組（P<0.05）；Cel1μg/ml組和SIMVA組LO2細(xì)胞內(nèi)SREBP-1c和SREBP-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于Cel0.5μg/ml組（P<0.05）。
　　結(jié)論：1.ERS密切參與了NAFLD的脂變過(guò)程，在其發(fā)生發(fā)展起