尿酸酶基因工程菌的構建與分泌表達.pdf

1、尿酸是嘌呤分解代謝產(chǎn)物，部分動物將尿酸通過尿酸酶（Uricase,EC1.7.3.3）的作用轉化為水溶性更好的尿囊素排出體外，由于人類在進化過程中尿酸酶基因發(fā)生突變，因此，只能以尿酸的形式排出。尿酸排出體外有兩種途徑，一為通過腎臟排泄（約占排泄量的2/3），但是由于尿酸本身的水溶性有限，增加腎臟尿酸排泄通常易引起腎臟尿酸結石，更加重了對腎功能的損害；一是通過腸道排泄，腸道在排出尿酸中的作用正常情況下雖居于次要地位（約占排泄量的1/3），

2、但是可降低通過腎臟排泄的副作用，主要通過采用蒙脫石吸附、活性炭吸附、腸道透析、進食含高膳食纖維的食物等措施降低腸道尿酸水平，它們或具有降低腸腔尿酸濃度或具有阻止尿酸從腸道吸收入血，增加尿酸從糞便的排出進而具有降血尿酸的效果，但是這幾個方法有局限性，不適合長期治療應用。本實驗擬構建尿酸酶基因工程菌，使尿酸酶持續(xù)表達并分泌到胞外，促使腸道尿酸轉化為尿囊素，不僅可阻止腸道尿酸吸收入血，也可加速血尿酸向腸道的擴散，進而達到降低血尿酸的作用，為探

3、索高尿酸血癥新的治療手段提供依據(jù)。
　　1.構建重組原核表達載體pET-28a-sUOX
　　以產(chǎn)朊假絲酵母菌（中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC2.120）基因組DNA為模板，PCR擴增尿酸酶編碼基因，同時，以金黃色葡萄球菌（ATCC6538）基因組DNA為模板，PCR擴增金黃色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal protein a，SPA）信號肽編碼基因。重新改造原核表達載體pET-28a，利用PCR技

4、術刪除LacO和LacI序列，便于不需誘導劑的作用表達尿酸酶，同時便于轉化至DH5α中。將尿酸酶編碼基因和SPA信號肽編碼基因通過DNA連接實驗連接后克隆至pET-28a載體中，命名為pET-28a-sUOX,進行測序。測序結果與GenBank查詢結果一致。
　　2.尿酸酶的表達
　　將測序正確的重組表達載體pET-28a-sUOX轉化到DH5α中，不需誘導劑的作用進行目的蛋白表達。分別收集6h、9h、12h、15h、18h