嗜冷細(xì)菌△9脂肪酸脫氫酶的基因克隆與功能研究.pdf

1、脂肪酸脫氫酶是生物體合成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶之一，也是生物調(diào)節(jié)細(xì)胞膜組成與功能的重要酶，其研究日益受到重視。從動(dòng)物、植物、真菌和藻類等不同生物體中克隆到脂肪酸脫氫酶基因，并獲得了功能性表達(dá)，但細(xì)菌來源的脂肪酸脫氫酶相關(guān)研究很少。本文篩選了土壤嗜冷細(xì)菌，研究了嗜冷細(xì)菌的分布及脂肪酸組分特征、嗜冷細(xì)菌△9脂肪酸脫氫酶的基因克隆與表達(dá)、酶相關(guān)性質(zhì)、酶系統(tǒng)進(jìn)化與功能性氨基酸殘基鑒定等。
　　 采用15℃的培養(yǎng)條件，從低溫環(huán)境下的土壤樣品

2、中富集并分離到32株嗜冷細(xì)菌，其中革蘭氏陽性菌6株，革蘭氏陰性菌26株。根據(jù)細(xì)胞脂肪酸組成的多樣性，選擇具有代表性的11株細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定與分類，它們分布在Psychrobacter、Pseudomonas、Pseudochrobactrum、Sphingobacterium、Arthrobacter、Bacillus和Pseudoalteromonas等7個(gè)屬。除1株只能鑒定到屬外，其余10株均可鑒定到種。革蘭氏陽性菌細(xì)胞脂肪酸中C1

3、5支鏈飽和脂肪酸的含量高于90％；革蘭氏陰性菌脂肪酸的不飽和度均超過50％，主要含不飽和的C16或C18直鏈脂肪酸，揭示了革蘭氏陽性菌和陰性菌不同的細(xì)胞膜脂肪酸組分的低溫適應(yīng)機(jī)制。總結(jié)以上結(jié)果，本研究選擇了高不飽和脂肪酸含量的海洋嗜冷細(xì)菌Pseudoalteromonas haloplanktis M15及嗜冷細(xì)菌Psychrobacter urativorans DSM14009作為脂肪酸脫氫酶基因的供體菌。
　　 采用COD

4、EHOP PCR策略和改良的基因組步移方法快速高效地從Psy。urativorans DSM14009中克隆了△9脂肪酸脫氫酶的編碼基因PuFAD9(GenBankaccession no.EF617339)。該基因的氨基酸序列與Psychrobacter arcticus273-4推測(cè)的△9脂肪酸脫氫酶具有79％一致性，具有整膜脫氫酶特征性的疏水分布和三個(gè)組氨酸富集區(qū)。將PuFAD9基因轉(zhuǎn)化E.coli并誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白的N端融合有

5、T7 tag，其分子量大約為60 kDa，主要定位于細(xì)胞膜。它具有△9脂肪酸脫氫酶活性，能催化細(xì)胞中棕櫚酸轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸。在15℃下表達(dá)，重組菌C16脂肪酸中棕櫚油酸含量由34％增加到88％，而棕櫚酸含量由66％減少到12％。另外顯示培養(yǎng)溫度顯著影響細(xì)胞中不飽和脂肪酸的含量，25℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h，重組菌中棕櫚油酸與棕櫚酸的比率是15℃下表達(dá)的2.4倍，與該酶在兩個(gè)溫度下的表達(dá)水平一致。表明溫度影響脂肪酸脫氫酶的合成，從而影響棕櫚酸到棕

6、櫚油酸的轉(zhuǎn)化。37℃下盡管有蛋白表達(dá)條帶，但沒有觀察到棕櫚油酸的積累，很可能因?yàn)檩^高溫度下，脂肪酸脫氫酶的折疊可能受到影響。在25℃下誘導(dǎo)4 h，脫氫酶的蛋白表達(dá)量和in vivo活性最大。
　　 從嗜冷海洋細(xì)菌Pseu.haloplanktis M15中克隆到脂肪酸脫氫酶基因PhFAD9。該基因的一級(jí)序列與Pseu.haloplankits TAC125推測(cè)的脂肪酸脫氫酶序列(Genbank accession no.YP_3

7、41374)同源性高達(dá)99.7％，其第304個(gè)氨基酸由賴氨酸K突變?yōu)榫彼酭。系統(tǒng)發(fā)育分析證明該序列與其他海洋細(xì)菌的脂肪酸脫氫酶推測(cè)序列也具有很高的同源性。用HMMTOP、TMHMM、DAS、TMpred、SOSUI、TopPred和Phobius等七種在線軟件對(duì)其進(jìn)行了跨膜螺旋預(yù)測(cè)。用Phobius軟件分析得到的Pseu.haloplanktis脂肪酸脫氫酶的膜拓?fù)鋵W(xué)模型，與文獻(xiàn)報(bào)道的其他整膜脫氫酶的膜拓?fù)鋵W(xué)模型一致。PhFAD9基因

8、在E.coli中表達(dá)的蛋白產(chǎn)物具有△9脂肪酸脫氫酶活性。25℃下誘導(dǎo)2 h后，重組菌C16脂肪酸的不飽和度達(dá)到91.7％，增加為對(duì)照菌中的近兩倍，棕櫚油酸與棕櫚酸的比率由對(duì)照菌中的0.9提高到11。
　　 來源于Psy.urativorans DSM14009和Pseu.haloplanktis M15的△9脂肪酸脫氫酶都能利用棕櫚酸和硬脂酸為底物，且更適于轉(zhuǎn)化棕櫚酸。硬脂酸并非E.coli宿主的主要內(nèi)源脂肪酸組分，培養(yǎng)基中預(yù)先

9、加入400μmol·L-1硬脂酸的條件下，在重組菌PuFAD9和PhFAD9的細(xì)胞總脂肪酸(硬脂酸除外)中分別檢測(cè)到4.3％和2.0％的油酸，顯示該類酶對(duì)硬脂酸的活性可能較低。
　　 比對(duì)了已報(bào)道的功能確定的整膜△9脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列，除藍(lán)細(xì)菌的第三個(gè)組氨酸富集區(qū)最后一個(gè)氨基酸殘基為酪氨酸Y，這類酶三個(gè)保守的組氨酸富集區(qū)特征為HRXXXH，XWXXXHRXHH，HNXHHXF。以藍(lán)細(xì)菌中A9脂肪酸脫氫酶作為外群，采用鄰近連

10、接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹?！?脂肪酸脫氫酶主要分為藍(lán)細(xì)菌、植物、細(xì)菌、真菌和動(dòng)物△9脂肪酸脫氫酶等5個(gè)單系群。確立了細(xì)菌脂肪酸脫氫酶的進(jìn)化地位，對(duì)該類酶的深入研究具有一定的指導(dǎo)意義。
　　 根據(jù)多序列比對(duì)結(jié)果，將Psy.urativorans脫氫酶序列中功能未被驗(yàn)證的保守殘基G212、H217、W220和S297分別突變?yōu)镠，N，G和K。25℃下誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，用SDS-PAGE和蛋白印跡方法檢測(cè)到Psy.urativorans△9

11、脫氫酶和其突變酶都有表達(dá)。在培養(yǎng)基中添加或不加硬脂酸的條件下，表達(dá)野生酶的重組菌細(xì)胞脂肪酸中棕櫚油酸的含量分別為22％和26％，是棕櫚酸的1.5和1.8倍。而突變株的棕櫚油酸與棕櫚酸組成與不含脂肪酸脫氫酶基因的對(duì)照株接近。在添加硬脂酸培養(yǎng)的野生酶重組菌中還能檢測(cè)到4％的油酸，但從突變酶重組菌中未檢出油酸。表明G212H，H217N，W220G和S297K四處單點(diǎn)突變都能導(dǎo)致Psy。urativorans△9脂肪酸脫氫酶失活，說明G212