基于差異蛋白組學(xué)對外濕環(huán)境下脾陽虛大鼠的發(fā)病機制研究.pdf

1、目的：
　　明確人工模擬外濕環(huán)境對正常及脾陽虛大鼠一般情況、脾組織形態(tài)學(xué)改變、脾組織蛋白質(zhì)差異表達的影響,探討濕邪對不同體質(zhì)（正常與脾陽虛）機體的致病機理。
　　方法：
　　1.選取40只SD大鼠隨機分為對照組、脾陽虛組、外濕組、脾陽虛加外濕組,每組10只。脾陽虛組模型制作采用番瀉葉灌胃與皮下注射利血平交替進行并強迫大鼠游泳的復(fù)合方法。脾陽虛造模后,給予外濕組與脾陽虛加外濕組人工模擬外濕環(huán)境一周,于造模前后觀察并記錄各

2、組大鼠的一般情況包括體質(zhì)量、進食量、飲水量、精神活動、皮毛光澤度及大便性狀并進行宏觀癥候評分。
　　2.模擬外濕環(huán)境造模完成后,無菌摘除脾臟,采用ConA誘導(dǎo)脾淋巴細胞增殖,以此表示淋巴細胞的功能水平。記錄并計算脾淋巴細胞增殖能力。
　　3.模擬外濕環(huán)境造模完成后,取脾組織進行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。每個組織塊切取5張切片,60℃恒溫箱內(nèi)過夜干燥切片,5張切片均做常規(guī)的HE染色,光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。
　　4.模擬外濕環(huán)

3、境造模完成后,取出脾組織10mg/只,進行雙向電泳實驗以及圖象分析,采用肽質(zhì)量指紋圖譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜的方法鑒定蛋白質(zhì)。
　　結(jié)果：
　　1.外濕對正常及脾陽虛大鼠一般情況的比較。外濕環(huán)境下脾陽虛大鼠較正常大鼠體質(zhì)量明顯減輕,脾陽虛加外濕組大鼠體質(zhì)量（239.30±37.60）較外濕組（321.70±18.74）顯著降低,P＜0.01。脾陽虛加外濕組大鼠在進食、飲水、精神狀態(tài)、毛色、大便性狀等方面較外濕組發(fā)生了一定的變化。脾

4、陽虛加外濕組大鼠進食量（19.33±2.88）較外濕組（23.83±2.93）降低,P＜0.05。外濕組（37.50±1.87）、脾陽虛加外濕組大鼠飲水量（36.67±4.18）較對照組（42.67±2.34）顯著降低,P＜0.01。脾陽虛加外濕組大鼠造模初期出現(xiàn)情緒逐漸改變,呈現(xiàn)易激怒、好爭斗狀態(tài),放在泳池中游泳時,紛紛躍起。造模后逐漸出現(xiàn)精神萎靡不振,扎堆,嗜睡, 反應(yīng)遲鈍,行動遲緩,毛色枯槁,消瘦,糞便軟、不成形,甚至稀

5、溏。外濕組大鼠脫毛現(xiàn)象較輕,精神狀態(tài)較好,偶可見嗜睡,抓取時叫聲比較溫柔。
　　2.外濕對正常及脾陽虛大鼠脾淋巴細胞增殖力的比較。外濕環(huán)境下，脾陽虛大鼠與正常大鼠脾淋巴細胞增殖力較對照組均顯著降低。與對照組脾淋巴細胞增殖力（47.94±1.13）相比,外濕組脾淋巴細胞增殖力（15.15±2.18）、脾陽虛加外濕組脾淋巴細胞增殖力（14.42±2.24）均顯著降低 P＜0.01。脾陽虛加外濕組脾淋巴細胞增殖力（14.42±2.24）

6、較外濕組脾淋巴細胞增殖力（15.15±2.18）無差別 P=0.476,P＞0.05。與脾陽虛加外濕組脾淋巴細胞增殖力（14.42±2.24）相比,脾陽虛組脾淋巴細胞增殖力（36.07±3.05）顯著增強P＜0.01。
　　3.外濕對正常及脾陽虛大鼠脾組織形態(tài)學(xué)的改變。外濕組大鼠脾組織白髓邊緣帶增寬,白髓發(fā)生中心增大,脾索內(nèi)見吞噬淺黃色色素細胞。脾陽虛加外濕組大鼠脾組織白髓邊緣帶增寬較明顯,脾竇內(nèi)見吞噬淺黃色色素細胞,脾竇擴張、充

7、血,脾索內(nèi)見吞噬淺黃色色素細胞。
　　4.外濕對正常及脾陽虛大鼠脾組織差異蛋白斑點表達情況的比較。各實驗組選三個樣本進行差異蛋白組學(xué)比較,兩兩比較差異蛋白圖譜,進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,鑒定出40個蛋白斑點,脾陽虛加外濕組與對照組比較表達上調(diào)的有13個,表達下調(diào)的有20個；外濕組與對照組比較表達上調(diào)的有14個,表達下調(diào)的有19個；外濕組與脾陽虛加外濕組比較表達上調(diào)的有15個,表達下調(diào)的有10個。
　　5.外濕對正常及脾陽虛大鼠脾組

8、織差異蛋白質(zhì)的比較。在實驗組2-DE凝膠上從表達差異蛋白質(zhì)斑點中選取點影像清晰且表達水平改變明顯的22個蛋白質(zhì)斑點作為最終質(zhì)譜鑒定的對象,利用 PMF的方法成功鑒定了20個蛋白質(zhì)。外濕環(huán)境下正常大鼠表達上調(diào)的有11個,它們是載脂蛋白A-I、蘋果酸脫氫酶、特定短鏈?；o酶A脫氫酶、半乳糖凝集素5、低分子量的磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶LMW-PTP、陰離子型胰蛋白酶原-2、胞內(nèi)氯離子通道蛋白1、f肌動蛋白β亞基、磷酸甘油酸變位酶1、膜突蛋白、肌動

9、蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物亞基5,表達下調(diào)的有4個,它們是3-磷酸甘油醛脫氫酶、哺乳動物過氧化物酶2、Igκ鏈C區(qū),B等位基、結(jié)合珠蛋白。外濕環(huán)境下脾陽虛大鼠表達上調(diào)的有9個,它們是載脂蛋白 A-I、蘋果酸脫氫酶、特定短鏈?；o酶A脫氫酶、半乳糖凝集素5、低分子量的磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶LMW-PTP、陰離子型胰蛋白酶原-2、胞內(nèi)氯離子通道蛋白1、磷酸甘油酸變位酶1、膜突蛋白,表達下調(diào)的有5個,它們是3-磷酸甘油醛脫氫酶、哺乳動物過氧化物酶

10、2、結(jié)蛋白、Igκ鏈C區(qū),B等位基、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈9。
　　結(jié)論：
　　1.模擬外濕環(huán)境因素對正常及脾陽虛組大鼠的一般情況都有影響,包括體質(zhì)量、進食量、飲水量、精神狀態(tài)、活動度、皮毛光澤、皮膚黏膜、排泄物等方面,并且對脾陽虛組影響更為明顯。
　　2.模擬外濕環(huán)境因素顯著降低了正常及脾陽虛組大鼠細胞免疫功能。模擬外濕環(huán)境因素（外因）相對于脾陽虛因素（內(nèi)因）對機體免疫抑制作用更強。模擬外濕環(huán)境因素（外因）與脾陽虛因素（內(nèi)

11、因）具有協(xié)同致機體免疫機能下降的作用。
　　3.模擬外濕環(huán)境因素對正常及脾陽虛大鼠脾組織形態(tài)學(xué)都有影響,但脾陽虛大鼠脾組織形態(tài)改變明顯,表現(xiàn)在組織細胞病變加重。
　　4.模擬外濕環(huán)境因素對正常及脾陽虛大鼠脾組織蛋白質(zhì)存在差異表達。模擬外濕環(huán)境因素與脾陽虛因素作用于機體差異蛋白質(zhì)有其特異性,但也存在交集,且交集很大。這些差異蛋白質(zhì)功能與細胞結(jié)構(gòu)、能量代謝、細胞凋亡、細胞增殖與分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、免疫保護、腫瘤