苯丙氨酸解氨酶菌株的選育及其全長cDNA序列的克隆.pdf

1、L-苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人和動物不能自身合成的必需氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于制藥、食品等多個領(lǐng)域。L-苯丙氨酸是合成一些抗癌藥物的中間體，以它為載體，可以把抗腫瘤藥物的分子或基團(tuán)載入腫瘤區(qū)，達(dá)到既能抑制腫瘤生長又能降低原腫瘤藥物毒性的目的。L-苯丙氨酸還可抑制心肌成纖細(xì)胞的增生，為防治高血壓提供新的方法。研究證明L-苯丙氨酸在抗腫瘤、抗癌等方面有顯著作用，具有廣闊的發(fā)展前景。L-苯丙氨酸最主要的用途是作為食品添加劑阿斯巴

2、甜合成的原料。阿斯巴甜是由苯丙氨酸和天門冬氨酸合成的，甜度為蔗糖的200倍，熱量是等量蔗糖的1/200。阿斯巴甜廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。人們食用后，阿斯巴甜由人體的酶分解轉(zhuǎn)化為氨基酸，被人體吸收后，對人體有營養(yǎng)保健功能。另外，人們食用阿斯巴甜，其殘留部分不會轉(zhuǎn)化為乳酸，因此，對人們的牙齒沒有腐蝕作用。對預(yù)防齲齒病，特別是對兒童的健康有益。還有一重要有點(diǎn)，阿斯巴甜適合糖尿病人食用，因它不需胰島素介入分解，不會增加血糖。總之，阿斯巴甜適用

3、于糖尿病、高血壓、心臟病、肥胖癥患者。 苯丙氨酸解氨酶(PAL)是通過轉(zhuǎn)氨作用合成L-苯丙氨酸，它不但作為工具酶用L-苯丙氨酸的制備，而且本身具有一定的藥用價值，用于治療實驗鼠的某些腫瘤，進(jìn)行血清L-苯丙氨酸的定量酶法分析，苯丙酮尿癥的診斷和治療時效果明顯。研究表明PAL在抑制某些腫瘤細(xì)胞效果顯著。PAL可迅速抑制癌變細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞的分裂和生長，對正常細(xì)胞影響不大。機(jī)理可能是PAL降解L-苯丙氨酸從而降低腫瘤細(xì)胞

4、生長所必需的氨基酸，使腫瘤細(xì)胞因“饑餓”而停止生長，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。現(xiàn)臨床上用脂質(zhì)體包被PAL，可提高酶的催化效率，延長半衰期，降低免疫原性，達(dá)到更理想的治療效果。 PAL廣泛分布在高等植物、真菌、酵母菌和唯一的原核生物-鏈霉菌中。然而，在動物中尚未發(fā)現(xiàn)有該酶存在。PAL在高等植物內(nèi)，是次生代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，在植物防御方面起著重要作用。在微生物體內(nèi)，PAL使得微生物可以利用L-苯丙氨酸做為唯一碳源。PAL在酵母菌尤其

5、是紅酵母家族含量最為豐富。本文選擇Rhodosporidiumpaludigenum作為研究材料，對其形態(tài)特征、生理生化特征、核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(intergenicspacer region,ITS)序列分析，不同物質(zhì)對產(chǎn)PAL的影響以及誘變育種作了研究。并且對菌株JM432產(chǎn)PAL基因的全長cDNA序列進(jìn)行克隆。在形態(tài)特征和生理生化特征分類的基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)方法對PAL產(chǎn)生菌JM432進(jìn)行了分類鑒定。菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征，部分生理

6、生化反應(yīng)研究表明菌株JM432具有紅色酵母的形態(tài)特點(diǎn)，不發(fā)酵任何糖，無合成類淀粉化合物的能力，利用硝酸鉀迅速而強(qiáng)烈。測定和分析了菌株的18S-26S rRNA ITS序列。研究結(jié)果表明，菌株JM432為紅冬孢酵母屬中的Rhodosporidium paludigenum。 通過單因素實驗，研究了L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸，銨根離子，無機(jī)鹽，微量元素對PAL活力的影響。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物對PAL的影響不大，

7、當(dāng)L-苯丙氨酸濃度為0.1％時，PAL活力僅為對照的123.04％；L-異亮氨酸濃度為0.1％時，PAL的活力為對照的121.25％；L-酪氨酸抑制PAL的合成；無機(jī)鹽-鐵離子對PAL有激活作用，酶活力達(dá)到對照的192.17％；在培養(yǎng)基中添加0.1％的硫酸銨，PAL活力為對照的258.56％；微量元素-銅離子對PAL的影響最大，酶活力為對照的384.56％。 以JM432作為實驗出發(fā)菌株：制備菌懸液，加入8-MOP(甲氧基補(bǔ)骨質(zhì)

8、素，methoxy-psoralen)黑暗中放置30分鐘。8-MOP是一種光敏試劑，8-MOP與長波紫外線復(fù)合可以產(chǎn)生誘變效應(yīng)，常用于治療某些皮膚病。將8-MOP應(yīng)用于PAL的突變株篩選目前尚未有報道。紫外燈下照射誘變，紅光下涂布篩選平板。本研究采用的篩選方法是類似物篩選系統(tǒng)。L-苯丙氨酸是PAL的作用底物，可以誘導(dǎo)酶的合成。L-酪氨酸是L-苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，是PAL的不良底物，即Km值較高。酵母菌要在這種結(jié)構(gòu)類似物存在時較好地生長

9、，只能合成更多的PAL。通過類似物篩選系統(tǒng)，獲得了大量的突變株，進(jìn)而從中篩選到PAL活力提高90％以上，遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)菌株ZW115。同時篩選到一株37℃下生長良好，PAL活力提高二倍(與相同培養(yǎng)條件下的出發(fā)菌株相比較)，遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)菌株NR128。對突變株ZW115，NR128每日PAL活力進(jìn)行了研究，其中ZW115和NR128的酶活峰均出現(xiàn)在72小時，PAL活力分別是原始菌株的0.94倍，2.23倍。 盡管對酵

10、母產(chǎn)PAL的分子生物學(xué)研究取得了一些進(jìn)展，一些酵母完整的PAL基因已經(jīng)獲得并測序，但是有關(guān)Rhodosporidium paludigenum的完整cDNA序列目前尚不清楚。為了獲得PAL基因的全長cDNA序列，本研究根據(jù)Genbank上的紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)PAL蛋白，膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)PAL蛋白，粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)

11、PAL蛋白的氨基酸序列同源比對結(jié)果，選取同源性比較高的區(qū)段設(shè)計簡并引物，優(yōu)化設(shè)計了一對簡并引物。在設(shè)計簡并引物時，選擇同源性相對較低而不是最高的氨基酸序列，另外采用次黃嘌呤核苷酸代替簡并引物中的N，使其簡并度降低到96/64，兩者的退火溫度更加接近。在實驗中采用熱啟動和逐漸升溫PCR技術(shù)，成功地擴(kuò)增出一條650bp的cDNA片段。為了取得JM432 PAL cDNA基因的3'端序列，采用RACE-PCR技術(shù)，根據(jù)上述已取得的中間序列設(shè)計

12、合成一條基因特異性引物，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中采用oligo-d(T)接頭引物合成第一鏈cDNA，擴(kuò)增反應(yīng)中用基因特異性引物和通用接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增。通過3'RACE-PCR技術(shù)延伸了PAL基因的cDNA序列，獲得650bp的3'端序列。 在5'端序列的克隆中，同樣根據(jù)已取得的中間序列設(shè)計兩對基因特異性引物A1、S1，A2、S2以及末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物。用末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物在反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)

13、作用下反轉(zhuǎn)錄總RNA得到第一鏈cDNA，然后使用RNase H分解Hybrid DNA-RNA中的RNA鏈，用T4 RNA連接酶將單鏈cDNA環(huán)化形成首尾連接物。進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，第一輪擴(kuò)增用基因特異性引物A1和S1，第二輪擴(kuò)增采用巢式PCR，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，利用基因特異性引物A2和S2擴(kuò)增出未知mRNA的5'端。通過5'RACE-PCR技術(shù)延伸了PAL基因的cDNA序列，獲得了大約1800bp的5'端序列。 將RAC