鹽膚木苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其功能性質(zhì)研究.pdf

1、鹽膚木（Rhuschinensis）是漆樹(shù)科(Anacardiaceae)，鹽膚木屬（Rhus）落葉小喬木，它作為中國(guó)經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的樹(shù)種，可供制藥、榨油、觀賞和做工業(yè)染料的原料等。目前對(duì)鹽膚木的研究主要在其成分及藥用價(jià)值、形態(tài)特征、栽培方法和技術(shù)等方面，而有關(guān)其體內(nèi)防御酶的研究很少。
　　苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase，PAL)是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，植物的初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝就

2、是被它所連接，PAL是與植物的抗逆性密切相關(guān)的酶，是一種防御酶。
　　本論文以鹽膚木為研究材料，對(duì)其PAL基因進(jìn)行分子克隆，構(gòu)建重組表達(dá)載體，經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)得到其重組蛋白，進(jìn)一步對(duì)其性質(zhì)和功能進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.本研究提取得到的鹽膚木總RNA，28SrRNA和18SrRNA的電泳條帶清晰，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，完整性很好，能用于后續(xù)分子克隆等實(shí)驗(yàn)。
　　2.首次得到鹽膚木PAL基因(RcPAL)的ORF序列。

3、RcPAL基因全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為2491bp，其中2124bp的ORF編碼707個(gè)氨基酸，5'端有一段197bp的非編碼區(qū)(5'UTR)，3'端有一個(gè)170bp的非編碼區(qū)(3'UTR)。RcPAL全長(zhǎng)cDNA序列是漆樹(shù)科中首次被報(bào)道的。
　　3.構(gòu)建成功重組表達(dá)載體pET-28a-PAL，長(zhǎng)度約為7500bp。在大腸桿菌中，此載體被誘導(dǎo)后得到約77kDa的重組蛋白。經(jīng)50％咪唑洗脫液得到純度及酶活性最高的RcPAL酶液。

4、　　4.RcPAL的最適pH為9.0，最適溫度為45℃，Ea為8.03kcal/mol。其動(dòng)力學(xué)曲線呈雙曲線型，底物L(fēng)-苯丙氨酸濃度增大，RcPAL的酶活性也增強(qiáng)，并從底物濃度為20mM開(kāi)始酶活性趨于平穩(wěn)。RcPAL的Km為7.9mM，Kcat為52.31s-1。
　　5.對(duì)3個(gè)重要位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功得到3個(gè)突變體，Phe126→His126(TTC→CAC)、Ser194→Trp194(TCG→TGG)、Asp374→Ala