銀杏查爾酮合成酶基因和苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及表達(dá).pdf

1、銀杏(Ginkgobiloba)葉黃酮具有重要的藥用價(jià)值，近年來(lái)對(duì)銀杏葉黃酮的研究，特別是如何提高銀杏葉黃酮含量已成為研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。對(duì)于提高銀杏葉黃酮的相對(duì)百分含量的研究，前人已有大量的報(bào)道，事實(shí)證明采用生理生化途徑調(diào)控銀杏葉黃酮相對(duì)百分含量是一種有效的方法。同時(shí)，利用植物基因工程技術(shù)對(duì)銀杏進(jìn)行遺傳改良或在分子水平上調(diào)控銀杏葉黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而提高銀杏葉黃酮含量也是一種行之有效的方法。銀杏葉黃酮合成代謝中涉及到十幾種酶

2、，而查爾酮合成酶(CHS)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是銀杏葉黃酮合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶。因而，開(kāi)展銀杏查爾酮合成酶和苯丙氨酸解氨酶的研究具有重要的理論意義與實(shí)踐價(jià)值。 本研究以此為基礎(chǔ)，以銀杏品種家佛手葉為試材，采用CTAB法提取DNA和RNA。利用RACE技術(shù)從銀杏中分離出查爾酮合成酶基因的cDNA全長(zhǎng)序列，利用1對(duì)簡(jiǎn)并引物分離出銀杏苯丙氨酸解氨酶基因的部分序列，并利用半定量RT-PCR法對(duì)其不同時(shí)期mRNA的表達(dá)與其活性變化

3、以及黃酮積累的相互關(guān)系進(jìn)行了初步的研究，主要結(jié)果如下： 1.采用CTAB法分別提取銀杏葉的DNA和RNA，提取的DNA經(jīng)電泳檢測(cè)，有清晰的主帶，酶切效果較好，說(shuō)明提取的DNA質(zhì)量較好。抽提的RNA經(jīng)電泳檢測(cè)，可見(jiàn)28srRNA和18srRNA兩條主帶；紫外吸收值測(cè)量，A260/A280接近2.0；反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA經(jīng)RAPD擴(kuò)增，出現(xiàn)清晰的條帶，這些說(shuō)明提取的RNA與DNA純度高，質(zhì)量好。該法簡(jiǎn)便易行，適合于富含多糖、多酚植物

4、材料的核酸提取。 2.采用1對(duì)簡(jiǎn)并引物，以銀杏葉DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了長(zhǎng)863bp的銀杏CHS基因片段，GenBank登錄號(hào)為AY563038。利用TAIL-PCR方法，擴(kuò)增得到了長(zhǎng)為1238bp的CHS基因片段，包含CHS基因3’末端基因組序列，GenBank登錄號(hào)為AY945936。 3.利用RACE技術(shù)從銀杏中分離出類黃酮合成代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶基因CHS基因，并命名為Gbchs，GenBank登錄號(hào)為D

5、Q054841。GbchscDNA全長(zhǎng)共1608bp，該序列包含poly(A)尾結(jié)構(gòu)和一個(gè)長(zhǎng)1173bp的最大開(kāi)放閱讀框架(ORF)，編碼391個(gè)氨基酸。通過(guò)核苷酸和蛋白質(zhì)序列多重比較發(fā)現(xiàn)：Gbchs與其它植物的CHS基因高度同源。GbCHS蛋白質(zhì)序列中包含與MsCHS相一致的活性位點(diǎn)。GbCHS蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)模型表明：GbCHS與MsCHS蛋白質(zhì)的晶體模型是非常相似的，這說(shuō)明GbCHS蛋白質(zhì)與MsCHS蛋白質(zhì)可能有相同的催化功能

6、。CHS的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，GbCHS與裸子植物的CHS基因聚類關(guān)系最近。GbchsSouthernblot結(jié)果表明銀杏CHS是一個(gè)多基因家族。 4.利用簡(jiǎn)并引物，以銀杏葉DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)862bp的銀杏PAL基因2片段，并命名為Gbpal，GenBank登錄號(hào)為AY578145。Gbpal編碼287個(gè)氨基酸。通過(guò)核苷酸和蛋白質(zhì)序列多重比較發(fā)現(xiàn)Gbpal與其它植物的PAL基因高度同源。GbPAL蛋白質(zhì)序列包含與水稻、玉

7、米PAL基因相類似的活性位點(diǎn)。PAL的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明：Gbpal與裸子植物的PAL基因聚類關(guān)系最近。GbpalSouthernblot結(jié)果表明銀杏PAL是一個(gè)多基因家族。 5.采用半定量RT-PCR方法定量分析了銀杏葉生長(zhǎng)過(guò)程中的CHSmRNA與PALmRNA相對(duì)表達(dá)量的變化，并分別結(jié)合CHS活性變化、PAL活性變化以及黃酮含量的變化曲線進(jìn)行了線性回歸分析。結(jié)果表明：CHSmRNA相對(duì)表達(dá)量變化與CHS活性變化是同步的，可用CH