銀杏時(shí)黃酮積累相關(guān)基因克隆及查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子功能研究.pdf

1、為了深入研究銀杏葉黃酮合成的分子機(jī)理,為今后利用生物技術(shù)手段提高銀杏黃酮含量奠定基礎(chǔ),本文從銀杏中克隆并研究了與黃酮積累相關(guān)的幾個(gè)酶基因:查爾酮異構(gòu)酶(GbCHI),類黃酮3'-羥化酶(F3'H),烯醇式丙酮基莽草酸3磷酸合成酶(EPSP),肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)及查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子(CHSP)序列。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 (1)銀杏查爾酮異構(gòu)酶基因(GbCHI)的克隆、性質(zhì)及表達(dá)模式的研究。利用簡(jiǎn)并PCR和R

2、ACE技術(shù)從銀杏葉片中克隆得到GbCHI的cDNA序列和基因組全長(zhǎng)。通過(guò)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),基因組GbCHI含有兩個(gè)內(nèi)含子三個(gè)外顯子,GbCHI cDNA全長(zhǎng)為926bp,含有一個(gè)735bp的開放式閱讀框(OPF),編碼244個(gè)氨基酸序列,預(yù)測(cè)分子量為26.29kDa,等電點(diǎn)為7.76。蛋白質(zhì)同源序列分析表明,GbCHI與TypeⅠ型CHI同源性較高。CHIs蛋白序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示GbCHI未聚合到兩類中,且分化時(shí)間早于TypeⅠ和Ty

3、peⅡ型CHI。Southern blot分析表明,GbCHI屬于多基因家族;GbCHI重組蛋白大腸桿菌表達(dá)顯示,其蛋白大小與cDNA序列預(yù)測(cè)蛋白大小一致,親和層析及Western blot分析顯示,重組GbCHI且含有6xHis標(biāo)簽,GbCHI能在大腸桿菌中正常表達(dá);重組GbCHI酶活性分析表明,GbCHI具有TypeⅠ型CHI的酶催化特點(diǎn),即催化6'-羥基查爾酮生成(2S)-黃烷酮;RT-PCR分析顯示,GbCHI基因在銀杏不同組織

4、中都有表達(dá),但存在較大差異,只有成熟葉和雄蕊中表達(dá)量最高。CHI與銀杏葉黃酮含量的年周期變化分析顯示,CHI基因的轉(zhuǎn)錄水平與CHI的酶活性呈線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.421;酶活性與黃酮的年周期變化之間也呈線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.373。激素和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示,雖然誘導(dǎo)表達(dá)模式不盡相同,但GbCHI轉(zhuǎn)錄水平能被UV-B、CCC、ABA、ALA和ETH誘導(dǎo)上調(diào),而被GA抑制表達(dá);GbCHI誘導(dǎo)表達(dá)模式與銀杏葉黃酮的調(diào)控變化相一致,暗示G

5、bCHI在銀杏黃酮代謝過(guò)程中具有關(guān)鍵酶作用。
　　 (2)銀杏類黃酮3'-羥化酶基因(GbF3'H)的克隆、性質(zhì)及表達(dá)模式研究。利用簡(jiǎn)并PCR和RACE技術(shù)從銀杏葉片中克隆得到了GbF3'H的cDNA全長(zhǎng)序列。通過(guò)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GbF3'H的cDNA全長(zhǎng)為2144 bp,含有一個(gè)1671 bp的開放式閱讀框(ORF),編碼556個(gè)氨基酸序列。蛋白質(zhì)同源序列分析表明,GbF3'H與其他物種F3'H同源性較低,而與菊苣(Cichor

6、ium intybus)同源性最高,為56.3％。同源建模分析顯示GbF3'H與P450家族蛋白的三維結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)高度相似,最終定位于微粒體膜上。F3'Hs蛋白序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示GbF3'H與其他植物分化較早。Southernblot分析表明,GbF3'H屬于多基因家族。GbF3'H重組蛋白大腸桿菌表達(dá)顯示,其蛋白大小與cDNA序列預(yù)測(cè)蛋白大小基本一致,親和層析及Western blot分析顯示,重組GbF3'H含有6xHis標(biāo)簽

7、,GbF3'H能在大腸桿菌中正常表達(dá)。RT-PCR分析顯示,GbF3'H基因在銀杏不同組織中都有表達(dá),其中雄蕊表達(dá)水平最高,其次為成熟葉。激素和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示,雖然誘導(dǎo)表達(dá)模式不相同,但GbF3'H轉(zhuǎn)錄水平能被UV-B、6-BA、SA、ABA和IAA誘導(dǎo)上調(diào),而傷害處理對(duì)其表達(dá)量無(wú)明顯改變。GbF3'H誘導(dǎo)表達(dá)模式與銀杏ANS基因的表達(dá)模式相似,而且其上游調(diào)控序列也發(fā)現(xiàn)有相關(guān)的調(diào)節(jié)單元,意味著該GbF3'H基因可能參與了銀杏花色素

8、的合成代謝。
　　 (3)銀杏烯醇式丙酮基莽草酸3磷酸合成酶(EPSPs)的克隆、性質(zhì)及表達(dá)模式研究。利用簡(jiǎn)并PCR和RACE技術(shù)從銀杏葉中克隆到EPSP合酶基因(GbEPSPs)的cDNA全長(zhǎng)序列。信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),GbEPSP的cDNA全長(zhǎng)1403 bp,包含最大閱讀框(ORF)為1035 bp,編碼一個(gè)344氨基酸多肽序列。蛋白質(zhì)同源序列分析表明,銀杏EPSP合酶蛋白質(zhì)序列與其他物種的EPSP合酶同源性較高,在81％-84％

9、之間。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,在參試物種中GbEPSPs作為裸子植物與被子植物同聚為一類,但分歧時(shí)間相對(duì)更早。Southern blot分析表明,EPSPs基因有多個(gè)拷貝,屬于一個(gè)小的多基因家族。不同組織表達(dá)分析顯示,EPSPs基因在銀杏的葉和果中表達(dá)量最高,其次為莖,根中表達(dá)水平最低。草甘膦處理能顯著誘導(dǎo)銀杏EPSPs基因表達(dá)量升高,紫外能上調(diào)銀杏EPSPs基因表達(dá),ABA則誘導(dǎo)GbEPSPs表達(dá)量先升后降;溫度對(duì)GbEPSPs具有不同的

10、誘導(dǎo)作用,其中42℃高溫誘導(dǎo)最顯著4 h達(dá)最大值,后又迅速降低。暗示銀杏葉片中EPSPs基因在環(huán)境壓力下表達(dá)量升高有可能與芳香族氨基酸向黃酮類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化有關(guān)。
　　 (4)銀杏肉桂酰輔酶A還原酶基因(GbCCR)的克隆、性質(zhì)及表達(dá)模式研究。利用簡(jiǎn)并PCR和RACE技術(shù)從銀杏葉片中克隆得到了GbCCR的cDNA全長(zhǎng)序列。信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),GbCCR的cDNA全長(zhǎng)為1178 bp,含有一個(gè)972 bp的開放式閱讀框(ORF),編碼32

11、3個(gè)氨基酸序列。蛋白質(zhì)同源序列分析表明,GbCCR與其他物種CCR同源性相對(duì)較高,與挪威云杉(Picea abies)同源性最高,為68.6％;同源建模分析顯示GbCCR序列與其他家族蛋白的三維結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)高度相似。CCRs蛋白序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示GbCCR與其他植物分化較早。SouSern blot分析表明,GbCCR屬于多基因家族;GbCCR重組蛋白大腸桿菌表達(dá)顯示,其蛋白大小與cDNA序列預(yù)測(cè)融合蛋白大小基本一致,親和層析及W

12、estern blot分析顯示,重組GbCCR含有6xHis標(biāo)簽,GbCCR能在大腸桿菌中正常表達(dá);RT-PCR分析顯示,GbCCR基因在銀杏不同組織中都有表達(dá),但與其他黃酮類代謝基因表達(dá)差異較大,其中莖和根中表達(dá)水平最高,其次為成熟葉。GA和農(nóng)桿菌誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示,雖然二者都能誘導(dǎo)基因表達(dá),但GA能夠明顯誘導(dǎo)GbCCR轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),而農(nóng)桿菌侵染處理對(duì)其表達(dá)量無(wú)明顯改變。GbCCR誘導(dǎo)表達(dá)模式顯示,該基因可能主要參與組織及細(xì)胞壁中木質(zhì)素

13、的合成,而與抗病蟲害無(wú)明顯關(guān)系。
　　 (5)銀杏查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子(GbCHSF)的調(diào)控元件及功能分析。通過(guò)染色體步移方法從銀杏基因組中克隆到查爾酮合成酶基因(GbCHS)翻譯起始位點(diǎn)上游1711bp的啟動(dòng)子序列。生物信息學(xué)分析表明,該啟動(dòng)子片段中存在多個(gè)順式作用元件,包括紫外/藍(lán)光響應(yīng)單元、植物激素響應(yīng)單元、真菌誘導(dǎo)元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)、TATA-box和CAAT-box等。亞克隆了GbCHS轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1402 b