擬南芥β-葡糖苷酶19基因啟動子的克隆及功能初析.pdf

1、在對作物進行抗性改良、產(chǎn)量提高和品質(zhì)改進時，需要將外源基因轉(zhuǎn)入到特定的作物體內(nèi)，這些外源基因需要在相應(yīng)的啟動子序列調(diào)控下進行表達。由于目前用于遺傳改良的植物啟動子數(shù)量有限，本研究以擬南芥β-葡萄糖苷酶19（Beta-glucosidase，BGLU19）基因啟動子為研究對象對其進行活性分析，以期獲得適宜作物遺傳改良的啟動子，滿足植物基因工程的需要。
　　本研究首先對AtBGLU19啟動子的序列結(jié)構(gòu)進行分析，預(yù)測其中的組織特異性元件

2、和脅迫應(yīng)答元件。并通過設(shè)計特異引物克隆AtBGLU19啟動子，構(gòu)建植物表達載體，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥并篩選獲得轉(zhuǎn)基因純合植株。最后通過GUS組織化學(xué)染色對其活性進行了穩(wěn)定表達分析，并利用農(nóng)桿菌侵染煙草對其活性進行了瞬時表達分析。研究結(jié)果表明AtBGLU19啟動子是一個種子特異性表達啟動子，并且可以在異源植物中表達?？傊?，通過本研究為作物遺傳改良提供了一個可供選擇的種子高表達啟動子，也為后續(xù)β-葡萄糖苷酶基因功能研究、基因工程改造植物

3、β-葡萄糖苷酶基因從而獲得生產(chǎn)用β-葡萄糖苷酶打下良好的基礎(chǔ)。本論文的主要實驗結(jié)果如下：
　　1.利用生物信息學(xué)方法篩選獲得種子特異性表達基因。利用AtGenExpress Visualization Tool和Genevisible Expression Data等在線網(wǎng)站對TAIR網(wǎng)站擬南芥基因表達譜數(shù)據(jù)進行分析比較，發(fā)現(xiàn)AtBGLU19基因在種子中表達量非常高，是一個種子特異性表達基因，因此推測AtBGLU19啟動子可能是種

4、子特異性表達啟動子。
　　2.通過手動檢索和在線軟件PLACE、PlantCARE對AtBGLU19啟動子序列進行分析，鑒定出很多與組織特異性表達和脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。其中有作用明確且具相關(guān)性的三個種子特異性表達調(diào)控元件：GCN4元件（TGAGTCA）、AACA元件（AACAAAA）和ACGT元件（GTACGT）；以及響應(yīng)低溫、ABA和干旱脅迫的順式作用元件：四個ABA響應(yīng)元件ABRE（ACGTACA、CGTACGTGCA

5、和GACACGTGGC）、兩個與冷脅迫有關(guān)的as-1元件（TGACG）和ACGTCA元件、一個MBS干旱應(yīng)答元件（TAACTG）。
　　3.通過設(shè)計特異引物擴增AtBGLU19啟動子序列。經(jīng)過PCR擴增后，獲得的目的條帶回收純化，通過酶切克隆至表達載體。酶切及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了pBGLU19-GUS植物表達載體。
　　4.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法來獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，通過PCR擴增和抗生素進行篩選獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥純合

6、株系，對純系植株的種子、葉片、花、莢果等進行GUS染色實驗，結(jié)果表明AtBGLU19基因啟動子在種子中的表達量最高，AtBGLU19啟動子是種子特異性表達啟動子。
　　5.利用農(nóng)桿菌侵染法將植物表達載體pBGLU19-GUS注射到煙草葉片，用瞬時表達的方法驗證AtBGLU19基因啟動子異源表達情況。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入pBGLU19-GUS質(zhì)粒載體的煙草葉片被X-Gluc溶液染成藍色，而野生型煙草葉片無染色，表明AtB