耐高溫α-淀粉酶基因的克隆、表達及突變.pdf

1、本論文研究了出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌的生理及遺傳特性,對它所產(chǎn)的耐高溫α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)作了初步分析.提取地衣芽孢桿菌的染色體DNA,設(shè)計合適引物,運用PCR法擴增得到了耐高溫α-淀粉酶基因,并將其克隆在大腸桿菌中.運用重組PCR技術(shù)對耐高溫α-淀粉酶基因進行定點突變.主要研究以下內(nèi)容:1.地衣芽孢桿菌020401所產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的主要性質(zhì)為:最適pH為6.5左右,最適作用溫度為85℃,但在95℃時也能保持較高活性.2.提取地衣芽孢桿

2、菌020401的染色體DNA,設(shè)計引物,通過PCR擴增得到了1.9kb的基因片段.將其克隆在pUC19質(zhì)粒上,并轉(zhuǎn)化Escherichia coli JM109,運用藍白選擇及透明圈法篩選到了一株陽性克隆JM109/pUAM.3.通過酶活測定及蛋白電泳分析證明JM109/pUAM菌株能分泌外源基因的表達產(chǎn)物即耐高溫α-淀粉酶,目的蛋白大小約為60000左右.4.對此基因片段進行測序,并將測序結(jié)果同已發(fā)表的地衣芽孢桿菌耐高溫α-淀粉酶基因

3、序列進行比對,同源性高達99﹪以上.5.將該基因克隆在表達型載體pGEM-3Zf(+)上并轉(zhuǎn)化E.coli JM109,同樣得到了一株能產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的陽性克隆JM109/pGAM,SDS-PAGE電泳證明其產(chǎn)生的目的蛋白大小同JM109/pUAM菌株大小相同,酶活測定表明菌株JM109/pGAM分泌目的蛋白的能力比JM109/pUAM強.6.運用重組PCR技術(shù)對目的基因編碼第134位氨基酸殘基和第320位氨基酸殘基的密碼子分別進行