人XPD基因的cDNA克隆及真核表達(dá)載體pEGFP-N2-XPD的構(gòu)建.pdf

1、目的 人類著色性干皮病D組基因(Xeroderma pigmentosum group D，XPD)，又叫做ERCC2基因(X-ray repair cross-complementing group 2)在1990年被首次克隆，它位于19q13.2-3，包含23個(gè)外顯子，長(zhǎng)約5413kb。XPD基因編碼一個(gè)由761個(gè)氨基酸組成，具有ATP依賴的5’→3’DNA解旋酶活性的蛋白，分子量為8619kDa。XPD蛋白是基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TFⅡH

2、復(fù)合物的第二大亞基，人類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TFⅡH是一個(gè)由九個(gè)亞基(XPB，XPD，p62，p52，p44，p34，cdk7，cyclinHT和MAT1)組成的復(fù)合體，其中XPB，p62，p52，p44和p34組成一個(gè)核心亞復(fù)合物，cdk7，cyclinHT和MAT1組成一個(gè)具有CDK活性的激酶(cdk active kinase，CAK)亞復(fù)合物。TFⅡH在轉(zhuǎn)錄起始和核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair，NE

3、R)中都發(fā)揮著重要作用，但XPD亞基在轉(zhuǎn)錄和修復(fù)中的作用卻是不同的。在核苷酸切除修復(fù)過(guò)程中，它可從5，→3’方向打開受損位置的DNA雙鏈，從而允許損傷特異性核酸酶從兩側(cè)切下受損DNA。而在轉(zhuǎn)錄起始階段，XPD的作用是介導(dǎo)CAK錨定在TFⅡH核心亞復(fù)物上，并且與P44亞基的N端相互作用，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。XPD基因的突變與三種人類遺傳性疾病相關(guān)，分別是XP，Cockayne綜合癥(Cockayne Syndrome，cs)和毛發(fā)硫性營(yíng)養(yǎng)不良

4、(Trichothiodystrophy，TTD)。 紫外線照射、吸煙和環(huán)境中的各種因素都可以使DNA發(fā)生各種損傷，如果這些損傷不能及時(shí)被清除并修復(fù)，累積將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，例如腫瘤。因此，各種涉細(xì)胞的DNA修復(fù)能力(DNA repair capacity，DRC)的基因一旦發(fā)生突變，則有可能使腫瘤易感性增強(qiáng)。NER是體內(nèi)最重要的DNA修復(fù)途徑之一，XPD作為TF Ⅱ H介導(dǎo)的NER和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的重要元件，它與腫瘤的關(guān)系也被越來(lái)

5、越廣泛的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，XPD基因某些位點(diǎn)的多態(tài)性與各種腫瘤(如頭頸部癌，前列腺癌，膀胱癌和乳腺癌等)發(fā)生易感性密切相關(guān)。除此之外，XPD還與烷化劑類抗腫瘤藥物(如順鉑)的耐藥性產(chǎn)生有關(guān)。XPD的表達(dá)在一定程度上受抑癌基因p53的調(diào)控。在對(duì)乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引發(fā)的肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的研究中發(fā)現(xiàn)，HBV合成的HBx蛋白(Hepatitis B vi

6、rus X protein)可以抑制p53序列特異性轉(zhuǎn)錄活性，從而破壞p53介導(dǎo)的凋亡、DNA修復(fù)和細(xì)胞周期。并且}玎3x對(duì)NER的抑制可在依賴與非依賴p53的多個(gè)途徑進(jìn)行，它對(duì)XPD也有直接和間接的抑制作用。HBx通過(guò)抑制細(xì)胞的NER活性，引起大型DNA加合物的堆積，是它的致癌機(jī)制之一。XPD與HBx的相互關(guān)系可能是我們進(jìn)一步了解并治療HBV引發(fā)的HCC的重要切入點(diǎn)。 XPD的各種生物學(xué)功能以及它與其它因子的相互作用機(jī)制正在被

7、廣泛的研究。在本課題中，我們成功克隆了人野生型全長(zhǎng)XPD cDNA，構(gòu)建出pEGFP-N2／XPD重組表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究XPD在各種疾病中的生物學(xué)功能并最終應(yīng)用于臨床基因治療提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法 1、用DMEM+10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)人HeLa細(xì)胞，從HeLa細(xì)胞中提到取RNA：2、自行設(shè)計(jì)上下游各帶有Bgl Ⅱ和Kpn I限制性酶切位點(diǎn)的PER引物，采用RT—PCR技術(shù)，將總RNA反轉(zhuǎn)錄eDNA，再擴(kuò)增出XPD基因全長(zhǎng)

8、eDNA片段；3、用限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ和Kpn Ⅰ分別雙酶切pEGFP-N2質(zhì)粒和XPD eDNA片段，電泳分離后回收純化兩端帶不同粘性末端的pEGFP-N2質(zhì)粒和XPD cDNA片段；4、用T4DNA連接酶連接雙酶切并回收純化后的pEGFP-N2質(zhì)粒和XPD eDNA片段；5、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌JM—109，在含有終濃度為30mg/m1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)24小時(shí)后，挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落擴(kuò)增，提到并純化

9、重組體質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD；6、用三種方案的限制性核酸內(nèi)切酶酶切初步鑒定所構(gòu)建重組載體pEGFP-N2/XPD，得出肯定結(jié)果后通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步鑒定；7、將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Hep3B，48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒中綠色熒光報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)情況。 結(jié)果 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在預(yù)期位置顯示了清晰的亮帶，這一結(jié)果提示已成功擴(kuò)增出了特異性的目的基因XPD　cDNA；將分別雙酶切

10、后的pEGFP-N2質(zhì)粒和XPD cDNA片段用T<,4>DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM—109，經(jīng)卡那霉素篩選，在培養(yǎng)皿上可見陽(yáng)性菌落；挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)增并提取純化出的重組體質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD分別經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ單切，BglⅡ和KpnⅠ雙切，SphⅠ單切后，酶切圖譜結(jié)果顯示與預(yù)期相符；進(jìn)一步將重組體進(jìn)行基因測(cè)序分析，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)克隆的人XPD基因cDNA序列與Genebank[NM_000400

11、.2]公布的人XPD基因cDNA序列一致，這一結(jié)果表明重組體pEGFP-N2/XPD中插入的目的基因XPD為正向、單倍插入；將重組體質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Hep3848小時(shí)后，在綠色熒光顯微鏡可見到pEGFP-N2質(zhì)粒所帶報(bào)導(dǎo)基因(GFP)正常表達(dá)綠色熒光蛋白，由于插入的XPD cDNA序列是在GFP序列之前，因此該結(jié)果表明插入序列可在真核細(xì)胞中正常表達(dá)。 結(jié)論 我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次成功克隆了人XPD基因野生型全長(zhǎng)