農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗寒基因轉(zhuǎn)化羽衣甘藍(lán)的初步研究.pdf

1、羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var.acephala)，屬于十字花科，是蕓薹屬食用甘藍(lán)的一個(gè)園藝變種。羽農(nóng)甘藍(lán)營養(yǎng)價(jià)值高，熱量低，是非常受歡迎的保健蔬菜，同時(shí)又具有良好的觀賞價(jià)值。其色彩豐富絢麗，葉形多樣，觀賞期長，耐寒性好，可耐多次-5℃～-10℃短暫霜凍，在園林綠化中具有重要的意義。我國北方冬季持續(xù)時(shí)間長，溫度低，羽衣甘藍(lán)在室外觀賞的應(yīng)用中抗凍性還有待于進(jìn)一步的提高，使其在長期霜凍下保持良好的觀賞性。植物的抗寒性是

2、多基因控制的性狀，以傳統(tǒng)育種手段改良有一定的困難，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗寒基因?qū)朐耘嗥贩N可能成為提高植物抗寒性的一種比較快速有效的手段。本實(shí)驗(yàn)以提高羽衣甘藍(lán)抗凍能力為目的，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入甜菜堿合成基因BADH和抗寒轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因TCF，期望得到可以在冬季露天觀賞的羽衣甘藍(lán)新品種。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.優(yōu)化羽衣甘藍(lán)的再生體系，篩選出再生能力強(qiáng)的3個(gè)羽衣甘藍(lán)品種
　　 通過對不同激素配比的培養(yǎng)基上，9種基因

3、型羽衣甘籃的帶柄子葉、下胚軸、真葉的再生情況進(jìn)行比較分析，從中篩選出皺白1，06-56和05-25這3種高效再生基因型，其最適培養(yǎng)基分別為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，MS+6-BA1.4mg/L，MS+6-BA1.0mg/L，獲得的最高不定芽誘導(dǎo)率均可達(dá)到100％；芽誘導(dǎo)率差的有玫紅、05-20和皺白2，不足70％。說明不同基因型羽衣甘藍(lán)的不定芽誘導(dǎo)率不同，對培養(yǎng)基激素配比的要求也不同。最終優(yōu)化的羽衣甘藍(lán)離體再生

4、體系為：切取發(fā)芽3-4d的帶柄子葉，置于與品種對應(yīng)的最適培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽萌發(fā)，待芽伸長到1cm左右時(shí)轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基MS+0.1mg/LNAA上，根長1cm左右，移栽到營養(yǎng)缽中。
　　 2.建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系
　　 確定了羽衣甘藍(lán)最終的轉(zhuǎn)化條件：取發(fā)芽3-4d的無菌苗，切取帶柄子葉預(yù)培養(yǎng)2d，將二次活化，離心，用pH值5.2的MS液體培養(yǎng)基重懸至OD600值為0.3的菌液侵染，侵染時(shí)間5min，滅菌濾紙吸干，共培

5、養(yǎng)2d，延遲篩選3d，篩選培養(yǎng)后切去存活不定芽進(jìn)行生根。預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；延遲培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Carb500mg/L芽篩選培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.1 mg/L+Carb500mg/L+0.05‰Gly生根培養(yǎng)基：MS+NAA0.1 mg/L+Carb500mg/L+0.05