農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)化黑曲霉的初步研究.pdf

1、木聚糖是植物細(xì)胞中半纖維素的主要成分，是一種豐富的生物質(zhì)資源。其降解產(chǎn)物及生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物應(yīng)用廣泛，降解木聚糖的酶系主要包括木聚糖酶和木糖苷酶等，而黑曲霉是產(chǎn)木聚糖酶的主要菌種。本論文從分子水平對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的一株產(chǎn)酶菌株-黑曲霉2459進(jìn)行遺傳性能的改造，以提高菌株的產(chǎn)酶活力，具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　 (1)載體pBI-hph的構(gòu)建:首先嘗試通過(guò)不完全酶切的方法獲得潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)表達(dá)盒，但經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)仍不能獲得，之后

2、用PCR的方法獲得表達(dá)盒，與Ti質(zhì)粒pBI121載體大片段連接，在大腸桿菌DH5α中篩選得到含有hph表達(dá)盒的載體pBI-hph，用凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。
　　 (2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立:首先通過(guò)平板篩選的方法分別確定潮霉素B對(duì)黑曲霉的最小抑制濃度為60μg/ml，頭孢噻肟對(duì)農(nóng)桿菌的最小抑制濃度為150μM;采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將載體pBI-hph轉(zhuǎn)化到黑曲霉2459中。然而，通過(guò)轉(zhuǎn)化效率的比較，發(fā)現(xiàn)

3、載體pPK2的轉(zhuǎn)化效率比載體pBI-hph的轉(zhuǎn)化效率高的多，為實(shí)驗(yàn)方法研究的方便，選用載體pPK2繼續(xù)研究。對(duì)黑曲霉轉(zhuǎn)化菌株全基因組DNA提取后進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并通過(guò)繼代篩選的方法研究了轉(zhuǎn)化菌株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明:通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功地將載體pBI-hph轉(zhuǎn)化到黑曲霉基因組上，所得轉(zhuǎn)化菌株能夠穩(wěn)定的遺傳。
　　 (3)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化:從農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)時(shí)間、乙酰丁香酮(AS)的濃度、培養(yǎng)基pH、受體形式等方面對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行優(yōu)

4、化，得到較優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件:農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)時(shí)間4小時(shí)、乙酰丁香酮的濃度200μM、培養(yǎng)基的pH4.75、農(nóng)桿菌的初始濃度OD600=0.7、共培養(yǎng)時(shí)間36小時(shí)、受體形式以勻漿處理的黑曲霉菌體為好，在這些條件下pPK2對(duì)黑曲霉的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到120個(gè)/107個(gè)孢子;通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化菌株木聚糖酶活測(cè)定，篩選得到酶活較黑曲霉2459提高86％的轉(zhuǎn)化菌株。
　　 (4)高產(chǎn)木糖苷酶黑曲霉菌株的初步構(gòu)建:分別對(duì)保存在pGEM-TEasy Vector

5、上的木糖苷酶基因XlnD，以及從質(zhì)粒pPK2上PCR獲得的啟動(dòng)子Pgpd、終止子TtrpC的兩端設(shè)計(jì)引物，每?jī)啥沃g加有15bp的堿基重疊，經(jīng)PCR反應(yīng)并純化，同時(shí)對(duì)質(zhì)粒pPK2進(jìn)行HindⅢ單酶切并純化，將各目的片段在In-Fusion HD Cloning Kit中進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。對(duì)轉(zhuǎn)化單菌落進(jìn)行菌落PCR及質(zhì)粒單酶切驗(yàn)證，并將符合條件的單菌落質(zhì)粒提取后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明成功將木糖苷酶基因插入到載體pPK2上