新分離致病螺原體單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、2002年王文等首次在水生動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)致病螺原體，并根據(jù)“科霍氏法則”確定其為中華絨螯蟹(crab)顫抖病的病原體[1,2]。隨后相繼在發(fā)病克氏原螯蝦(crayfish)和南美白對蝦(prawn)體內(nèi)分離培養(yǎng)出致病螺原體[28]。蝦蟹顫抖病是近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖上的一大瘟疫。2006年，我國養(yǎng)殖的水產(chǎn)甲殼類動物因病害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失為49.5億元，其中對蝦類損失28.43億元，蟹類損失19.83億元，嚴(yán)重制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前，國際上

2、對蝦蟹螺原體的分類鑒定還有待完善，蝦蟹顫抖病病原體是新發(fā)現(xiàn)的致病微生物，鑒定需經(jīng)過分離培養(yǎng)，宿主來源、血清學(xué)以及分子生物學(xué)的分析，根據(jù)國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)委員會(ICSB)制定的標(biāo)準(zhǔn)來鑒定和分類，其中一個重要的金標(biāo)準(zhǔn)是模式株的血清學(xué)鑒定[40]。此外，對其免疫學(xué)特性的研究，如中和抗原表位及特性，抗體對其生長抑制情況，抗原性差異與分子特性等，仍是空白。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速檢測病原體的手段有限，都是迫切需要解決的問題。因此，本研究制備了抗蝦蟹螺原體的單

3、克隆和多克隆抗體，并初步探討其應(yīng)用價(jià)值。 本研究用分離純培養(yǎng)的中華蟹螺原體(S.crab)、南美白對蝦螺原體(S.prawn)、克氏原螯蝦螺原體(Scrayfish)混合物免疫Balb/c小鼠，按常規(guī)方法融合，得到2株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為6H7和7C8。再分別用中華絨螯蟹螺原體(Scrab)和南美白對蝦螺原體(S.prawn)免疫家兔，按常規(guī)方法制備了抗S.crab抗血清和抗S.prawn抗血清。 免

4、疫印跡試驗(yàn)顯示：6H7和7C8單抗均能與中華蟹螺原體(Scrab)、南美白對蝦螺原體(Sprawn)和克氏原螯蝦螺原體(S.crayfish)反應(yīng)，而不與S.mirum、蜜蜂螺原體(Ssp.CH-1)、油菜花螺原體(S.sp.CR-1)以及螺原體培養(yǎng)基等反應(yīng)。間接ELISA試驗(yàn)顯示：兩株單抗與Smirum，Ssp. CH-1，Ssp. CR-1以及支原體呈陰性反應(yīng)，說明兩株單抗均為針對蝦蟹螺原體的特異性抗體。也從免疫學(xué)角度證明S.cra

5、b，S.prawn和S.crayfish與以往人們熟知的支原體、蜜蜂和油菜花螺原體有不同的抗原表位和免疫學(xué)特性。抗Scrab和抗S.prawn多克隆抗體Western blot和ELISA結(jié)果顯示：兩種多抗均與S.mirum有交叉反應(yīng)，從血清學(xué)角度提示蝦蟹致病螺原體與S.mirum的親緣關(guān)系接近。此前王文也報(bào)道，Scrab和S.mirum的16S rRNA基因有98％以上的同源性[2]。 同時(shí)，為了進(jìn)一步考查該致病螺原體是否會感

6、染哺乳動物，本研究以單克隆抗體為工具，應(yīng)用Western blot的方法檢測接種蝦蟹致病螺原體半年以上的小鼠腦、脊髓、脾臟、肌肉等組織，未發(fā)現(xiàn)螺原體的存在，提示暫無證據(jù)表明新型蝦蟹致病螺原體可以感染哺乳動物。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備了抗蝦蟹致病螺原體的特異性單克隆抗體和多克隆抗體。四種抗體的制備和初步分析結(jié)果在血清學(xué)上為蝦蟹致病螺原體的分類鑒定，確定種屬間關(guān)系提供了新的依據(jù)，為其免疫學(xué)特性及致病性的深入探討提供了可靠的工具，同時(shí)為