麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在畢赤酵母中的表達(dá)及活性分析.pdf

1、麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶是一種4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶,能催化直鏈淀粉環(huán)化生成大環(huán)糊精。大環(huán)糊精具有筒狀疏水內(nèi)腔和親水外表結(jié)構(gòu),可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)。麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在生物(包括微生物)體內(nèi)含量很低,不能滿足制備大環(huán)糊精和科研的需要。本文從E.coli BL21(DE3)plysS中擴(kuò)增得到麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因(MalQ),構(gòu)建了表達(dá)載體pPIC9K-MalQ,Sal I線性化,電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS11

2、5感受態(tài)細(xì)胞中,成功構(gòu)建了一株基因工程菌。pPIC9K-MalQ／GS115。利用0.8％甲醇誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)上清進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基活性分析,TLC結(jié)果顯示表達(dá)上清液具有糖基轉(zhuǎn)移酶作用,證實(shí)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在畢赤酵母中成功表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)生的麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶和直鏈淀粉反應(yīng),制備得到一系列大環(huán)糊精的混合物。本文主要結(jié)論如下:
　　 (1)PCR擴(kuò)增得到的MalQ基因,構(gòu)建了表達(dá)載體pPIC9K-MalQ。對(duì)其進(jìn)行酶切和測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST

3、比對(duì),與GenBank中報(bào)道的E.coliBL21(DE3)MalQ基因的同源性為100％。
　　 (2)表達(dá)載體用Sal I線性化,電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中,構(gòu)建了基因工程菌pPIC9K-MalQ／GS115。0.8％甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)上清液與麥芽糖溶液反應(yīng),TLC結(jié)果顯示:上清液具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性。SDS-PAGE電泳顯示,上清液在78.5kDa位置處有明顯條帶,與麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的理論分子量相符。葡萄糖氧