胚胎干細(xì)胞自我更新和分化研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 miR23a～27a～24在胚胎干細(xì)胞分化中的功能研究
　　了解胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)維持自我更新及多向分化潛能的具體機(jī)制，對(duì)于人們未來(lái)更好的將其應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)非常重要。過(guò)去幾十年已經(jīng)對(duì)ESC中轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路層面上的調(diào)控機(jī)制開(kāi)展了較全面的研究，也勾畫(huà)出ESC維持其特征的具體整體框架。除了各種轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)調(diào)形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控外，人們也逐漸認(rèn)識(shí)到

2、表觀遺傳修飾，如組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼RNA等，也可以協(xié)同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來(lái)共同維持ESC狀態(tài)基因的表達(dá)。其中microRNA在ESC自我更新及分化中發(fā)揮了重要的功能，在ESC中將Dicer和DGCR8敲除均顯示ESC分化存在缺陷，說(shuō)明microRNA在胚胎干細(xì)胞的自我維持尤其是分化中具有非常關(guān)鍵的作用。人們對(duì)于促進(jìn)ESC自我更新和多潛能性，提高iPS細(xì)胞重編程效率的microRNA研究較多。但是，對(duì)于抑制ESC自我更新，促進(jìn)分化

3、的microRNA則研究較少。
　　本課題組在前期的研究工作發(fā)現(xiàn)位于小鼠8號(hào)染色體上的miR-23a～27a～24-2基因簇（miR-23a基因簇）的兩個(gè)成員miR-27a和miR-24在分化細(xì)胞和組織中呈現(xiàn)不同程度的高表達(dá)，通過(guò)靶基因Oct4、Foxo1、gp130、Smad3、Smad4實(shí)現(xiàn)對(duì)ESC自我更新的抑制，并能夠促ESC多胚層分化，抑制二者的表達(dá)能顯著提高三因子介導(dǎo)的iPS細(xì)胞形成的效率，同時(shí)有促進(jìn)胚層特異性分化的相關(guān)

4、報(bào)道。考慮到上述工作很多是在特定修飾的細(xì)胞系或者體外開(kāi)展，對(duì)miR-27a和miR-24-2在ESC分化中是否不可或缺這一問(wèn)題不能全面回答，miR-23基因家族除了miR-23a基因簇外，還包含有位于13號(hào)染色體上的miR-23b～27b～24-1基因簇（簡(jiǎn)稱miR-23b基因簇），這兩個(gè)基因簇共編碼5個(gè)microRNA: miR-23a，23b，27a，27b，24。miR-23b基因簇上三個(gè)成員miR-23b，27b，24-1的種子

5、序列與miR-23a基因簇中的三個(gè)成員完全相同，因此它們可能具有相同的靶基因及相應(yīng)的功能，在功能上有代償作用。因此，使用CRISPR/Cas9技術(shù)在V6.5細(xì)胞系中分別獲得miR-23a和23b雙基因簇純合敲除(DKO)和miR-23a基因簇純合敲除(KO)細(xì)胞系，而這是第一次由CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)雙microRNA基因簇的純合敲除。而后，將獲得DKO和KO ESC系通過(guò)EB形成實(shí)驗(yàn)、ES細(xì)胞向中內(nèi)胚層定向誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和畸胎瘤形成

6、實(shí)驗(yàn)確定上述miR-23a/b基因簇敲除ESC系的分化能力。在EB形成實(shí)驗(yàn)中，DKO細(xì)胞顯示導(dǎo)致中胚層分化缺陷而促進(jìn)其它胚層的分化，提示miR-23～27～24基因簇參與ESC自我更新的抑制和早期中胚層的形成;在心肌分化實(shí)驗(yàn)中，DKO ESC在任意天數(shù)都未觀察到博動(dòng)性cEBs，心肌特異標(biāo)志物Nkx2.5、Tbx5、a-MHC、b-MHC和cTnT等的表達(dá)量明顯降低。免疫熒光試驗(yàn)顯示沒(méi)有明顯的肌原纖維形態(tài)，三個(gè)心肌標(biāo)志物Actinin、A

7、NP和Troponin1的表達(dá)量也非常低，提示miR-23～miR-27～miR-24基因簇在心肌細(xì)胞分化中起著非常重要的作用;同過(guò)畸胎瘤體積大小和重量檢測(cè)顯示DKO ESC成瘤能力小于KO和野生型ESC，通過(guò)HE染色，DKO ESC來(lái)源的畸胎瘤中可以觀察到外、內(nèi)胚層的結(jié)構(gòu)，而幾乎沒(méi)有中胚層的結(jié)構(gòu)，并且存在大量未分化或低分化的區(qū)域;通過(guò)ESC的標(biāo)志物Oct4進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DKO ESC來(lái)源的畸胎瘤中存在大片Oct4染色陽(yáng)性區(qū)域，

8、而野生型ESC來(lái)源的畸胎瘤中則幾乎沒(méi)有，KO ESC來(lái)源的畸胎瘤介于兩者之間。
　　第二部分 單倍體胚胎干細(xì)胞突變體文庫(kù)的建立和應(yīng)用
　　研究表明轉(zhuǎn)錄因子Oct4與Sox2是維持多能性所必須的，它們與其它一些轉(zhuǎn)錄因子共同組成了一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)建立及維持ESC的多能性。當(dāng)這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)被破壞時(shí)，ESC將退出多能性(Exit from Pluripotency)走向分化，但是，對(duì)于這一過(guò)程的機(jī)制，還有很多疑問(wèn)有待人們研究，目前在國(guó)際

9、上已經(jīng)有幾個(gè)研究團(tuán)隊(duì)利用正向遺傳學(xué)篩選(Forward Genetics)方法獲得了與調(diào)控ESC退出多能性相關(guān)的候選基因。但這些研究都有自身的局限性，另外，將這些遺傳篩選的結(jié)果放在一起分析會(huì)發(fā)現(xiàn)相互間的重復(fù)性很差，只有少數(shù)幾個(gè)基因（如Tcf3）在不同研究中都被篩選出來(lái)，這也從側(cè)面說(shuō)明上述研究還遠(yuǎn)沒(méi)有全面揭示ESC退出多能性進(jìn)入分化狀態(tài)的相關(guān)因子及其作用機(jī)制。
　　由于多數(shù)基因的性狀為隱性的，只有兩個(gè)等位基因都發(fā)生突變時(shí)，性狀的變化

10、才顯現(xiàn)出來(lái)，因此獲得基因組范圍的純合突變細(xì)胞文庫(kù)是進(jìn)行正向遺傳篩選研究必要條件。haESC只具有一套染色體組，并具有ESC的所有特征，因而，在正向遺傳篩選工作具有更廣泛的優(yōu)勢(shì)，目前，在突變ESC基因的多種方法中，利用病毒載體和轉(zhuǎn)座子載體進(jìn)行的插入突變是使用較為廣泛的方法，而轉(zhuǎn)座子載體沒(méi)有病毒載體那樣顯著的基因組整合偏好性，可以覆蓋更多的基因。因此使用piggyBac轉(zhuǎn)座子載體攜帶的基因誘捕(Gene Trap)元件在haESC中構(gòu)建了4

11、個(gè)純合突變體文庫(kù)，約包含60000個(gè)突變克隆，通過(guò)Southern blot檢測(cè)其轉(zhuǎn)座子單拷貝插入插入的比例在74％，通過(guò)Splinkerette-PCR結(jié)合“三引物競(jìng)爭(zhēng)性PCR”鑒定純合突變的比例在85％以上，通過(guò)Splinkerette-PCR結(jié)合高通量測(cè)序的方法確定構(gòu)建的文庫(kù)中55％以上的插入位點(diǎn)位于基因內(nèi)，其約涵蓋18000個(gè)以上的基因。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個(gè)包含460個(gè)突變克隆的小規(guī)模矩陣式突變體文庫(kù)，所謂“矩陣庫(kù)”就是在單倍

12、體胚胎干細(xì)胞混合庫(kù)的基礎(chǔ)上，將每一個(gè)突變克隆挑取到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中獨(dú)立培養(yǎng)。隨后利用兩種分化條件M15(-LIF)和N2B27對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了分化篩選，共獲得了33個(gè)仍可以呈ESC樣生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆;利用Splinkerette PCR結(jié)合常規(guī)測(cè)序確定了19個(gè)陽(yáng)性克隆在基因組中的插入位點(diǎn)，其中11個(gè)插入位點(diǎn)定位于已知基因，包含已知的與分化和發(fā)育相關(guān)的基因。接著，挑選了兩個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)座子捕獲載體被切除后，回復(fù)克隆在分化的條