填肥朗德鵝PBEF-Nampt-Visfatin基因cDNA的全序列擴(kuò)增及RT-PCR表達(dá)分析.pdf

1、PBEF/Nampt/Visfatin是2005年日本學(xué)者新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，位于染色體7q22.1和7q31.33之間，長(zhǎng)37.41kb;在進(jìn)化過程中高度保守，細(xì)菌、脊椎動(dòng)物海綿動(dòng)物門、魚類中都有同源蛋白。目前其相關(guān)功能及作用機(jī)制不明，現(xiàn)認(rèn)為主要作用為直接降低血糖的作用，作用效用約為胰島素的1/10。與肥胖與2型糖尿病等代謝性疾病緊密相關(guān)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過采用特殊動(dòng)物模型--朗德鵝，應(yīng)用強(qiáng)制填飼技術(shù)建立腹型肥胖動(dòng)物模型，分

2、析了填飼前后朗德鵝各項(xiàng)生理指標(biāo)及血糖、血脂指標(biāo)，以及其代謝紊亂狀態(tài)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)肥胖組和正常生長(zhǎng)組PBEF/Nampt/Visfatin基因脂肪、肝臟等13處組織的表達(dá)狀況，建立了組織表達(dá)譜，并進(jìn)行了兩組表達(dá)差異分析?？寺×死实蛮ZPBEF/Nampt/Visfatin基因部分序列，并根據(jù)該序列應(yīng)用RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，rapid-amplificationofcDNAends)獲得了朗德鵝

3、PBEF/Nampt/Visfatin的cDNA全序列并做了相關(guān)分析。
　　 1．動(dòng)物模型的建立及相關(guān)指標(biāo)分析
　　 方法：使用90日齡朗德鵝公鵝30只，隨機(jī)平均分為2組籠養(yǎng)。填肥組高頻填飼高能玉米，對(duì)照組自由采食普通飼料，兩組均自然采水。21天后測(cè)量體重（活重）、肝重、腹脂重；檢測(cè)血脂七項(xiàng)（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固、低密度脂蛋白膽固醇、脂蛋白、游離脂肪酸、磷脂）、血糖。并獲得組織樣本，液氮凍存后備用。

4、>　　 結(jié)果：填肥組較對(duì)照組體重、肝重、腹脂重(p＜0.01)極顯著增高，血糖顯著增高(P＜0.05)，血甘油三酯(P＜0.01)、總膽固醇和游離脂肪酸(P＜0.05)顯著增高，兩組間高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、膽固醇，脂蛋白和磷脂等指標(biāo)兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)；
　　 對(duì)照組中各參數(shù)相關(guān)性如下：肝重與腹脂重、肝重與磷脂呈極顯著正相關(guān)性、脂蛋白a與總膽固醇呈極顯著負(fù)相關(guān)性；高密度脂蛋白膽固醇與甘油三酯呈顯著負(fù)相關(guān)性、低

5、密度脂蛋白膽固醇與腹脂重呈顯著正相關(guān)性、游離脂肪酸與肝重呈顯著正相關(guān)性、游離脂肪酸與總膽固醇呈顯著正相關(guān)性。其他指標(biāo)見未見顯著相關(guān)性。
　　 填肥組中各參數(shù)相關(guān)性如下：體重與腹脂重顯著正相關(guān)性，總膽固醇與體重顯著負(fù)相關(guān)性，余指標(biāo)未見明顯相關(guān)性。
　　 2．建立組織表達(dá)譜及填肥組與對(duì)照組差異分析
　　 方法：Trizol技術(shù)提取各組織mRNA，根據(jù)NCBI上雞PBEF/Nampt/Visfatin基因全序列上保守段

6、設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA序列，克隆擴(kuò)增獲得精確部分朗德鵝PBEF/Nampt/Visfatin序列，根據(jù)此段精確序列設(shè)計(jì)熒光定量專用引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)獲得組織表達(dá)數(shù)據(jù)，通過2-△△方法分析得出兩組各組織的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：各組織中PBEF/Nampt/Visfatin基因均有不同程度表達(dá)，對(duì)照組與填肥組中肌肉組織表達(dá)均較高（胸肌、腿肌、心?。?、胰等實(shí)質(zhì)器官組織表達(dá)均較低；表達(dá)量高低如下：對(duì)照組：胸肌、腎、心

7、肌、腿肌、腹脂、胃、腦、皮下脂肪、腸、肝、胰、肺、脾；填肥組：胸肌、腿肌、心肌、肝臟、腹脂、腎、胃、肺、皮下脂肪、腦、脾、胰、腸。PBEF/Nampt/Visfatin基因表達(dá)量填肥組與對(duì)照組表達(dá)量半定量結(jié)果顯示，肥胖后脾臟與肝臟PBEF/Nampt/Visfatin基因表達(dá)增加，分別為對(duì)照組的6.8-38.05與5.57-6.94倍，小腸表達(dá)量減少，填肥組約為對(duì)照組的10％-39％;余組織個(gè)體差異較大，倍比關(guān)系不明顯。
　　

8、3．PBEF/Nampt/Visfatin全序列的獲得及分析
　　 方法：根據(jù)前述獲得PBEF/Nampt/Visfatin已知序列設(shè)計(jì)引物，使用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，克隆測(cè)序獲得全序列；通過在線核酸序列資源庫(kù)進(jìn)行氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并進(jìn)行各物種間該基因相似性比較。
　　 結(jié)果：獲得PBEF/Nampt/VisfatincDNA編碼區(qū)序列1481bp，鵝該基因與各物種相似性非常高。
　　 結(jié)