棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子的cDNA克隆與RT-PCR分析.pdf

1、WRKY家族是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，尚未見其在棉纖維發(fā)育過程中功能的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以陸地棉品種7235(GossypiumhirsutumL.)10DPA的胚珠為材料，以本實(shí)驗(yàn)室馬紅波獲得的WRKY基因cDNA片段為基礎(chǔ)，利用RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)克隆了一個(gè)cDNA全序列和兩個(gè)cDNA的3’末端，并對這三個(gè)片段進(jìn)行了棉花不同組織的RT-PCR分析。結(jié)果如下：1.利用3'RACE技術(shù)和5'RACE技術(shù)分別克隆了TF2-2片

2、段的3’末端和5’末端，進(jìn)一步拼接后得到一個(gè)完整的1673bp的cDNA克隆(GenBank登錄號：DW360766，GhWRKY1)。 DNAMAN軟件分析表明，此序列具有完整的開放讀碼框，編碼398個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在5’端有132bp的非翻譯區(qū)，3’端有347bp的非翻譯區(qū)并有Poly(A)尾。BLASTX(NCBI)檢索表明，此序列編碼的蛋白質(zhì)含有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，與擬南芥的TTG2蛋白有45％的同源性。RT-PCR分

3、析表明此基因在0DPA和5DPA胚珠、10、15、20、25、30DPA纖維以及花藥、葉片、胚軸和胚根中均表達(dá)，在35DPA纖維中不表達(dá)。 2.利用DNAMAN軟件，將GhWRKY1編碼的蛋白與其他物種的17個(gè)WRKY成員進(jìn)行了同源進(jìn)化分析。結(jié)果表明：GhWRKY1與可可的WRKY13以及調(diào)節(jié)擬南芥表皮毛早期發(fā)育的TTG2蛋白為同一個(gè)分支。因此，推測其可能執(zhí)行類似TTG2的功能，參與棉纖維發(fā)育早期的調(diào)控。3.利用3'RACE技術(shù)

4、克隆了TF2-3片段的3’末端，將其與TF2-3序列拼接后得到大小為1246bp的cDNA片段(TF2-3’)。BLASTX(NCBI)檢索結(jié)果表明，此序列編碼的蛋白含有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，與甘薯的SPF1蛋白有69％的同源性。RT-PCR分析表明此基因在0和5DPA胚珠、10、15、20、25、30DPA纖維以及花藥、葉片、胚軸和胚根中均表達(dá)，在35DPA纖維中不表達(dá)。4.利用3'RACE技術(shù)克隆了TF2-5片段的3’末端，將其與TF