枯草芽孢桿菌D21菌株纖溶酶發(fā)酵調(diào)控研究.pdf

1、目前，血栓性疾病已成為威脅人類生命健康的主要元兇之一。全世界許多研究團(tuán)隊(duì)都致力于溶栓藥物的研發(fā)。本課題對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）纖溶酶的發(fā)酵過程進(jìn)行了以下研究:
　　改進(jìn)了經(jīng)典的用于纖溶酶活測(cè)定的纖維蛋白平板法。首先按照經(jīng)典方法制板并點(diǎn)樣，使平板上形成纖維蛋白水解圈。然后用考馬斯亮藍(lán)R250對(duì)平板染色2 min，最后用脫色液(冰乙酸∶甲醇∶去離子水=1∶3∶6)進(jìn)行脫色處理。應(yīng)用AutoCAD軟件可以計(jì)算

2、出水解圈的面積。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過染色后纖維蛋白水解圈比染色前更清晰，更方便測(cè)定。而且染色后的平板只需室溫保藏避，免了未染色平板因放置時(shí)間太長(zhǎng)水解圈變大且可能染菌等問題。
　　研究了各種因素對(duì)枯草芽孢桿菌D21纖溶酶發(fā)酵的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)表明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基(5 g/Lyeast extract，10 g/L tryptone，10 g/L NaCl，40 g/L，pH7)發(fā)酵液上清酶活為278.89±11.48U/mL。碳源極顯著促進(jìn)纖溶酶發(fā)

3、酵(P＜0.01)，其中葡萄糖的促進(jìn)效果最強(qiáng)(1650.37±50.23U/mL)。氮源（除明膠外）極顯著抑制纖溶酶的發(fā)酵(P＜0.01)，其中NH4Cl的抑制效果最強(qiáng)（19.99±0.44 U/mL）。CaCl2和MgCl2可以分別顯著提高酶活至350.03±18.72 U/mL和354.15±24.44 U/mL(P＜0.05)，而CuCl2和ZnCl2可分別極顯著降低酶活至9.98±0.518 U/mL和16.60±3.235 U

4、/mL(P＜0.01)。初始pH為5時(shí)發(fā)酵效果最好（347.68±8.74 U/mL），而pH為9時(shí)發(fā)酵被抑制（酶活為0）。溫度為34℃時(shí)酶活最高（278.89±11.48U/mL），而42℃時(shí)酶活降至83.15±21.99 U/mL。
　　由于葡萄糖對(duì)發(fā)酵的促進(jìn)作用最強(qiáng)，故選擇加入葡萄糖的培養(yǎng)基(5g/Lyeast extract,10 g/L tryptone,10 g/L NaCl,40 g/L glucose, pH7)和

5、口基礎(chǔ)培養(yǎng)基一起研究培養(yǎng)周期對(duì)發(fā)酵的調(diào)控。結(jié)果表明，加入葡萄糖的培養(yǎng)基發(fā)酵液上清酶活于72 h達(dá)到最大值3488.09±5.72 U/mL，然而對(duì)照培養(yǎng)基同時(shí)刻的酶活僅161.36±5.72 U/mL。選擇72 h進(jìn)行更深入的研究，結(jié)果表明加入葡萄糖的培養(yǎng)基發(fā)酵液上清液中存在中性蛋白酶(neutral protease)和堿性絲氨酸蛋白酶(alkaline serine protease)兩種主蛋白酶，而對(duì)應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵液上清中僅存

6、在堿性絲氨酸蛋白酶這一種主蛋白酶，且豐度比含葡萄糖培養(yǎng)基中的堿性絲氨酸蛋白酶低。
　　通過PCR從枯草芽孢桿菌D21基因組中獲得了堿性絲氨酸蛋白酶的基因(AprE)并將序列提交至Genbank(KM519994.1)，將獲得的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)，在重組大腸桿菌發(fā)酵液上清液中可檢測(cè)到纖溶酶活性。進(jìn)一步研究表明，電泳純的堿性絲氨酸蛋白酶具有纖溶酶活性。此外，電泳純的中性蛋白酶