環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測嬰幼兒奶粉中肺炎克雷伯菌的研究.pdf

1、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）廣泛分布于自然界，該菌近年來成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌，主要存在于人和動物腸道、呼吸道、泌尿生殖道。國內(nèi)外相關(guān)研究表明:肺炎克雷伯氏菌也可通過一些不經(jīng)過加熱直接食用的食品引起食物中毒，例如涼拌菜、漢堡包、蔬菜沙拉等。國內(nèi)也有嬰幼兒配方奶粉中檢出肺炎克雷伯氏菌的報道。肺炎克雷伯氏菌可在全身各部位發(fā)生感染，也能引起腹瀉，特別是慢性腸炎和小兒腹瀉，對于新生兒和機體免疫力低者

2、，能引起腦膜炎、敗血癥等，發(fā)病死亡率極高。在食品安全面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)的形勢下，有必要建立肺炎克雷伯菌的快速診斷和鑒定技術(shù)。
　　目前對肺炎克雷伯菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的檢測方法，免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。其檢測方法一直沿用過去傳統(tǒng)的分離鑒定方法，己不能適應(yīng)現(xiàn)代快速檢測的要求。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新穎的核酸體外擴增技術(shù)，檢測嬰兒配方奶粉中的肺

3、炎克雷伯菌，靈敏度高，特異性強，檢測方法簡便，耗時短而且檢測成本低，能夠在基層普及和推廣。
　　針對肺炎克雷伯氏菌GenBank中的ophE基因(A04376.1.)，運用引物設(shè)計軟件(https://primerexplorer.jp.lamp3.0.0.index.html)進(jìn)行在線LAMP引物設(shè)計。對反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度等擴增條件進(jìn)行優(yōu)化，確定25μL的LAMP反應(yīng)體系:10μM FIP和BIP各3.5μL，10μ

4、MF3和B3各0.5μL，50mM MgSO41μL，2.5mmol/L dNTPs4μL,10×BstDNA聚合酶緩沖液，8U BstDNA聚合酶，2μL DNA模板，用滅菌雙蒸水補足25μL反應(yīng)體系。
　　LAMP反應(yīng)過程是首先在62℃水浴鍋中反應(yīng)60min，然后將其放入80℃水浴鍋中10min終止反應(yīng)，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀或者瓊脂糖凝膠電泳，即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。通過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切擴增產(chǎn)物，

5、測得酶切片段與理論預(yù)期值相符，驗證了方法的正確性。
　　本研究對3株肺炎克雷伯菌和18株其他食源性致病菌進(jìn)行特異性試驗。結(jié)果表明，3株肺炎克雷伯菌結(jié)果為陽性，其他18株菌株為陰性。
　　為了比較LAMP檢測肺炎克雷伯菌靈敏度和人工污染檢出限，以PCR方法作對照。PCR反應(yīng)的引物L(fēng)AMP的兩條外引物（F3和B3）。結(jié)果表明，LAMP檢測肺炎克雷伯菌和人工污染肺炎克雷伯菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為79CFU/mL，采用試劑盒提取D