環(huán)介導等溫核酸擴增(LAMP)技術檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的研究.pdf

1、2002年國際食品微生物標準化委員會(ICMSF)把阪崎腸桿菌列為“嚴重危害特定人群，危害生命或慢性實質(zhì)性后遺癥或長期影響”的一種致病菌。嬰兒配方奶粉是其最主要的傳播途徑，而且嬰兒配方奶粉中微量的阪崎腸桿菌污染(<3CFU/100g)也能導致感染的發(fā)生，因此檢測阪崎腸桿菌的方法是否靈敏、特異及快速至關重要。
　　 目前對阪崎腸桿菌的檢測方法主要有FDA推薦的傳統(tǒng)檢測方法，免疫學方法和PCR方法。傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣，檢測時間長，

2、而且靈敏度較低；免疫學方法的特異性和靈敏度也不理想；PCR方法敏感、快速，但由于需要昂貴的儀器設備、繁瑣的電泳過程，而使其難以在基層普及和推廣。采用環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP）技術，檢測嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌，靈敏度高，特異性強，檢測方法簡便，耗時短而且檢測成本低，能夠在基層普及和推廣。
　　 針對阪崎腸桿菌（ATCC29544）GenBank中

3、（基因號AY702093）16S-23S rRNA的保守序列，運用在線引物設計軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設計LAMP引物。對反應時間、反應溫度、鎂離子濃度等擴增條件進行優(yōu)化，確定25 μL的 LAMP反應體系為：內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.2 μM，外引物（F3和B3）各0.2 μM，環(huán)引物（LF和LB）各0.6 μM,2.5 mM dNTP，1.6 M甜菜堿,

4、4 mM MgSO4，10×Bst DNA聚合酶反應緩沖液,8U的Bst DNA聚合酶大片段,3 μL DNA模板和用滅菌雙蒸水補足體系。LAMP反應過程是首先在64℃水浴鍋中反應20min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴10min終止反應，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀，即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應。
　　 為了比較LAMP檢測阪崎腸桿菌靈敏度和人工污染檢出限，以 PCR方法作對照。PCR反應的引物是改良LAMP的兩條外

5、引物（F3和B3）。結果表明，改良LAMP檢測阪崎腸桿菌的檢出限為0.101CFU/mL，人工污染阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為1.100CFU/g。采用試劑盒提取DNA，從樣品處理到報告結果，耗時1h。對照PCR耗時3h，檢測阪崎腸桿菌的檢出限為101CFU/mL，人工污染阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為1100CFU/g。改良LAMP的靈敏度是PCR的1000倍。
　　 對普通LAMP和改良LAMP以及改良LAMP自身

6、加環(huán)引物和未加環(huán)引物進行了檢測阪崎腸桿菌純培養(yǎng)和人工污染檢出限的比較，結果表明，改良LAMP的靈敏度是普通LAMP和未加環(huán)引物改良LAMP的10倍。
　　 初步研究了6種模板制備方法對LAMP檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的影響。研究表明LAMP方法對制備模板DNA的要求不高。通過對實際樣品進行檢測，將本方法與行業(yè)標準SN/T1632.1-2005方法進行比較，確定LAMP方法敏感性為100％，特異性為98.15％，符合率為98.