食源性致病菌阪崎腸桿菌和痢疾志賀菌LAMP快速檢測(cè)技術(shù)的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、一、研究背景和目的:
　　 近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，食品安全已成為當(dāng)今世界性公共衛(wèi)生熱點(diǎn)。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，對(duì)人類健康造成極大危害，是食品安全的重大隱患。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步，食源性疾病并未減少或消失，世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件反而接連發(fā)生，食品安全形勢(shì)嚴(yán)峻。目前，食源性致病菌的檢測(cè)存在特異性差、操作繁瑣、耗時(shí)，以及不能現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用等問題。本研究旨在建立阪崎腸桿菌（EnterobacterSakaz

2、akii）和痢疾志賀菌（Shigelladysenteriae）兩種常見食源性致病菌的快速檢測(cè)方法。
　　 阪崎腸桿菌是一種重要的食源性致病菌，呈世界性分布，主要通過(guò)嬰幼兒配方奶粉經(jīng)消化道感染兒童，引起新生兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎，甚或遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥或?qū)е滤劳?。目前，引起阪崎腸桿菌感染事件的發(fā)生規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已成為我國(guó)重要的食源性致病菌。國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)于2002年將阪崎腸桿菌列為對(duì)特定人群產(chǎn)生嚴(yán)重的生命

3、危害或產(chǎn)生慢性后遺癥的微生物。國(guó)家質(zhì)檢總局于2005年8月頒布了檢測(cè)阪崎腸桿菌的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1632.1。2006年，針對(duì)嬰幼兒配方乳粉受阪崎腸桿菌污染的高風(fēng)險(xiǎn)性和污染后的巨大危害性，國(guó)家質(zhì)檢總局頒布了嬰幼兒配方乳粉中阪崎腸桿菌每批必檢的市場(chǎng)準(zhǔn)入要求。檢測(cè)阪崎腸桿菌的傳統(tǒng)方法步驟繁瑣，一般須耗時(shí)6d左右，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相繼建立了ELISA、PCR、核酸雜交等檢測(cè)技術(shù)。
　　 痢疾志賀菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的革蘭陰性無(wú)芽胞桿菌，

4、是一類具有較強(qiáng)傳染性、危害嚴(yán)重的革蘭陰性腸道致病菌，所致的細(xì)菌性痢疾(Shigellosis)是世界上尤其是發(fā)展中國(guó)家重要的傳染病之一，全球每年細(xì)菌性痢疾病例高達(dá)1.65億，其中1.63億發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，并導(dǎo)致110萬(wàn)患者死亡，其中60％以上為5歲以下兒童。近年來(lái)，痢疾志賀菌食物中毒的發(fā)生規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，成為我國(guó)首要的食源性致病菌之一。目前，我國(guó)常用的志賀氏菌的檢驗(yàn)方法主要是國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.5-2003)。整個(gè)檢測(cè)程序需

5、要3～5d完成，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，檢出限為104CFU/mL。免疫學(xué)方法簡(jiǎn)單，但靈敏度不高;PCR方法具有靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)成本較高，儀器昂貴，不適于基層單位推廣應(yīng)用。
　　 綜上，建立準(zhǔn)確、靈敏、操作簡(jiǎn)便、不依賴昂貴儀器的檢測(cè)方法對(duì)于食源性致病菌感染的診斷、疾病控制和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義;發(fā)展快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)與鑒定阪崎腸桿菌和痢疾志賀菌的方法成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)。目前，常用快速檢測(cè)方法主要有ELISA、DNA探針、常

6、規(guī)PCR、Real-timePCR等。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，依賴于能夠識(shí)別靶DNA上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，具有高特異性、快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。自從2000年以來(lái)，LAMP技術(shù)在臨床疾病的診斷、病原性細(xì)菌或病毒的定性檢測(cè)以及動(dòng)物胚胎性別鑒定等方面應(yīng)用廣泛。LAMP技

7、術(shù)在國(guó)內(nèi)起步較晚，應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)阪崎腸桿菌和痢疾志賀菌在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道較少。
　　 本研究針對(duì)阪崎腸桿菌外膜蛋白OmpA基因和痢疾志賀菌ipaH基因，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的LAMP引物，建立優(yōu)化的反應(yīng)體系，考察特異性和靈敏度，并應(yīng)用于食品樣品的直接檢測(cè)，初步建立阪崎腸桿菌和痢疾志賀菌的LAMP檢測(cè)方法。
　　 二、研究方法:
　　 1.阪崎腸桿菌LAMP快速檢測(cè)技術(shù)的建立與初步應(yīng)用
　　 (1)阪崎腸桿菌

8、LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立
　　 根據(jù)GenBank公布的阪崎腸桿菌外膜蛋白OmpA基因序列(Accessionnumber:DQ000206)的保守區(qū)，利用LAMP專用軟件PrimerExplorerversion4設(shè)計(jì)一套特異性引物，即外引物F3和B3、內(nèi)引物BIP和FIP，以阪崎腸桿菌(ATCC29544)提取的DNA為模板，建立檢測(cè)阪崎腸桿菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)體系，并對(duì)反應(yīng)體系內(nèi)各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終摸索出優(yōu)化后檢測(cè)阪崎腸

9、桿菌的LAMP反應(yīng)體系。
　　 (2)阪崎腸桿菌LAMP靈敏度、特異性實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品檢測(cè)
　　 利用建立的LAMP方法檢測(cè)阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物，考察其靈敏度。將過(guò)夜培養(yǎng)的阪崎腸桿菌(ATCC29544)菌液10倍倍比稀釋至10-1～10-8，取各稀釋度菌液100ul進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。同時(shí)取各稀釋度菌液1ml提取DNA，取2ul上清液作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增，測(cè)試兩種方法檢測(cè)阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度。
　　

10、 選取3株阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和大腸埃希菌、傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌等12株其它非阪崎腸桿菌致病菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)LAMP方法的特異性。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)所建立的LAMP和PCR的條件和參數(shù)，對(duì)36份奶粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與FDA檢測(cè)方法進(jìn)行比較。
　　 2.痢疾志賀菌LAMP快速檢測(cè)技術(shù)的建立與初步應(yīng)用
　　 (1)痢疾志賀菌LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立
　　 根據(jù)GenBank公布的痢疾志賀菌ipaH基因序列（Acces

11、sionnumber:M76445)中的保守區(qū)作為靶序列，設(shè)計(jì)痢疾志賀菌特異性引物，包括外引物F3和B3、內(nèi)引物BIP和FIP、環(huán)引物L(fēng)F和LB。以痢疾志賀菌(CMCC48097)提取的DNA為模板，建立檢測(cè)痢疾志賀菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)反應(yīng)體系內(nèi)各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。最終得出優(yōu)化后檢測(cè)痢疾志賀菌的LAMP反應(yīng)體系。
　　 (2)痢疾志賀菌靈敏度、特異性實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品檢測(cè)
　　 采用建立的LAMP方法檢測(cè)痢疾志賀菌純培

12、養(yǎng)液，考察其靈敏度。將過(guò)夜培養(yǎng)的痢疾志賀菌(CMCC48097)菌液10倍倍比稀釋至10-1～10-8，取各稀釋度菌液100ul進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。同時(shí)取各稀釋度菌液1ml提取DNA，取2μl上清液作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增，測(cè)試兩種方法檢測(cè)痢疾志賀菌純培養(yǎng)物靈敏度。
　　 同時(shí)選取4株志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和大腸埃希菌、傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌等其它非志賀菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)LAMP方法的特異性，初步應(yīng)用于人工污染豬肉樣品痢疾

13、志賀菌的檢測(cè)，并與常規(guī)PCR方法比較。
　　 三、結(jié)果:
　　 1.確定阪崎腸桿菌LAMP優(yōu)化反應(yīng)體系為:6mMMgCl2，0.6mMdNTPs，0.8Mbetaine，0.4μM外引物（F3和B3），1.6μM內(nèi)引物（FIP和BIP），8U的BstDNA聚合酶，2.5μlThermopolbuffer，2μLDNA模板，ddH2O補(bǔ)足體積至25μl;擴(kuò)增溫度58℃，反應(yīng)60min，產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳分析，得到典型

14、的LAMP梯形條帶，肉眼觀察反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀。
　　 LAMP法能檢出所有的阪崎腸桿菌菌株，產(chǎn)生特異性擴(kuò)增的梯形條帶，直接用肉眼觀察到焦磷酸鎂白色沉淀，而其它腸道致病菌均未產(chǎn)生特異擴(kuò)增的梯形條帶。LAMP對(duì)阪崎腸桿菌純菌液檢測(cè)靈敏度為2.0×101cfu/mL，PCR檢測(cè)靈敏度為2.0×102cfu/mL;LAMP檢測(cè)的靈敏度是傳統(tǒng)PCR靈敏度的10倍，檢測(cè)時(shí)間縮短了2～3h。采用LAMP法檢測(cè)36份奶粉樣品，其中2份

15、樣品檢出阪崎腸桿菌，陽(yáng)性率為5.6％，與FDA方法檢測(cè)結(jié)果一致。
　　 2.確定痢疾志賀菌的LAMP反應(yīng)體系為:5mMMgCl2，0.3mMdNTPs，0.6Mbetaine，0.4μM外引物（F3和B3），1.6μ.M內(nèi)引物（FIP和BIP）與1.6μM環(huán)引物（LF和LB），8UBstDNA聚合酶大片段，ThermoPolbuffer2.5μl，DNA模板2μl，ddH2O補(bǔ)足體積至25μl;擴(kuò)增溫度63℃反應(yīng)60min，產(chǎn)物

16、于2.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，得到典型的LAMP梯形條帶。
　　 LAMP法能檢出4株志賀菌，產(chǎn)生特異擴(kuò)增的梯形條帶，其余腸道致病菌均未產(chǎn)生特異擴(kuò)增的梯形條帶，表明選用的志賀菌ipaH基因引物的特異性強(qiáng)。LAMP法對(duì)痢疾志賀菌純菌液檢測(cè)靈敏度為5.3×101cfu/ml，對(duì)人工污染的豬肉樣品的痢疾志賀菌檢測(cè)限為6.8×101cfu/ml。PCR檢測(cè)的靈敏度為5.3×102cfu/ml，豬肉樣品為6.8×102cfu/mL，LAM

17、P的靈敏度均比傳統(tǒng)PCR靈敏度高10倍，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在2h內(nèi)完成。
　　 四、結(jié)論:
　　 本研究建立了乳制品中阪崎腸桿菌、肉制品中痢疾志賀菌的LAMP快速檢測(cè)技術(shù)，并在實(shí)際樣品檢測(cè)中得到了初步應(yīng)用。LAMP檢測(cè)技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條（6條）特異引物，特異性強(qiáng);LAMP檢測(cè)限為101cfu/mL，是PCR法靈敏度的10倍。LAMP法能直接對(duì)奶粉、肉制品、乳制品等食品中的致病菌進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)際樣品一般在20～28