CTB-LK密碼子多點突變及其優(yōu)化基因在畢赤酵母中的表達.pdf

1、CTB-LK是將蚓激酶(LK)和霍亂毒素B型亞單位(CTB)通過基因融合，并在畢赤酵母中獲得表達的一種新型抗血栓腸吸收蛋白，經(jīng)過體外和小鼠體內(nèi)實驗均證明CTB-LK具有很好的預期酶活和高效腸吸收特性。
　　 為提高CTB-LK的表達量，本研究以實驗室已有的CTB-LK基因為基礎(chǔ)，在不改變所編碼氨基酸的情況下，使用基因重疊延伸PCR(gene SOEing PCR)技術(shù)，對該基因中4個編碼氨基酸的密碼子位點進行定點突變，將4個畢赤

2、酵母稀有密碼子分別突變成畢赤酵母高頻密碼子。并構(gòu)建了優(yōu)化基因CTB-LKA的中間克隆載體pBluescript SK-CTB-LKA和畢赤酵母表達載體pPIC9k-CTB-LKA，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選獲得了CTB-LKA畢赤酵母表達菌株。
　　 對CTB-LKA畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物進行的SDS-PAGE實驗表明，在45kD處出現(xiàn)了預期條帶。在纖維平板溶栓實驗中，發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出纖維蛋白溶解酶的活性.表明CTB-LKA蛋白在

3、畢赤酵母內(nèi)得到了正確的表達和折疊。與同等體積CTB-LK畢赤酵母表達菌株發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳條帶對比，前者在45kD處的條帶更明顯。通過使用纖維蛋白平板實驗對CTB-LKA畢赤酵母表達菌株發(fā)酵產(chǎn)物溶纖活性測定結(jié)果表明，在BMGY/BMMY培養(yǎng)基中誘導36h后，酶活力達2450mm2/mL，比CTB-LK畢赤酵母表達菌株發(fā)酵產(chǎn)物酶活性提高了1.9倍。以上結(jié)果表明，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的CTB-LKA基因與未經(jīng)過密碼子優(yōu)化的CTB-LK