miR-214通過靶定Plexin-B1抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和增殖能力.pdf

1、目的： MicroRNA（miRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的能夠調(diào)控其靶基因表達(dá)水平的小RNA分子家族。近幾年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并確定了上千種miRNA，目前miRNA的功能研究正日益成為生物學(xué)一個(gè)非常活躍的研究領(lǐng)域。本研究旨在結(jié)合生物信息學(xué)、基因芯片及報(bào)告基因技術(shù)預(yù)測(cè)和確定miR-214在人類腫瘤細(xì)胞中的靶基因，并對(duì)miR-214通過調(diào)控靶基因而在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能進(jìn)行進(jìn)一步研究。 方法： 利用miRNA芯片技術(shù)對(duì)幾種

2、不同組織來源腫瘤細(xì)胞系中miR-214的表達(dá)水平進(jìn)行比較，隨后在使用miR-214反義寡聚核苷酸特異性抑制細(xì)胞內(nèi)miR-214功能后，利用MTT法和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)篩選分析miR-214對(duì)腫瘤細(xì)胞活性和增殖能力的影響。在此基礎(chǔ)上結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)程序和mRNA表達(dá)譜芯片以及半定量RT-PCR的結(jié)果對(duì)miR-214的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，并通過檢測(cè)GFP報(bào)告基因的方法進(jìn)行驗(yàn)證。隨后根據(jù)已知的該靶基因功能，應(yīng)用腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)和測(cè)定生長(zhǎng)曲

3、線的方法確定miR-214對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和增殖能力的調(diào)控作用。 結(jié)果： 通過對(duì)miRNA芯片結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)在人類腫瘤細(xì)胞系HT-29，HeLa，MCF-7，A549，K562，ES-2中miR-214的表達(dá)都保持在較一致的水平。隨后利用MTI法和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-214的功能進(jìn)行篩選分析，發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中miR-214功能受到抑制后腫瘤細(xì)胞的活性和增殖能力均明顯增強(qiáng)。 在此基礎(chǔ)上利用長(zhǎng)寡聚核苷酸

4、基因芯片（共7267個(gè)人類基因，包含凋亡相關(guān)基因、腫瘤相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、肝酶代謝相關(guān)基因、細(xì)胞因子相關(guān)基因）分析抑制miR-214的功能后mRNA表達(dá)譜的變化，選取部分表達(dá)有差異基因經(jīng)過半定量RT-PCR驗(yàn)證，最終得到與芯片結(jié)果相符的基因有四個(gè)：Plexin-B1，MDH1，COX5A和RAC1。其中Plexin-B1是靶基因預(yù)測(cè)程序分析后認(rèn)定的miR-214可能靶位點(diǎn)，在miR-214的功能被抑制后表達(dá)升高，我們通過檢測(cè)GF

5、P報(bào)告基因的方法確定了miR-214可以通過與Plexin-B13'UTR預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)區(qū)域的直接相互作用抑制報(bào)告基因GFP的表達(dá)。 隨后，根據(jù)已知的該靶基因功能，一方面通過測(cè)定生長(zhǎng)曲線確定了miR-214對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的抑制作用，另一方面利用腫瘤細(xì)胞趨化性運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)，證明了miR-214可以通過靶定：Plexin-B1而抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。 結(jié)論： 本文預(yù)測(cè)并首次確定了Plexm-B1是miR-214在人