蒙藥蓽茇降血脂有效成分蓽茇寧的含量分析、合成及其異構(gòu)體研究.pdf

1、我們課題組多年來對降血脂蒙藥—蓽茇進(jìn)行了深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)了天然化合物蓽茇寧(代號(hào)GBN)有顯著的降血脂活性，且毒性極低，并能夠防止早期動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生。此研究成果獲得了2項(xiàng)國家發(fā)明專利，入選國家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)的候選藥課題。
　　本文首先分析了十余種不同產(chǎn)地的蓽茇和胡椒當(dāng)中主要的兩種生物堿成分胡椒堿和蓽茇寧的含量，發(fā)現(xiàn)日本和越南產(chǎn)的蓽茇中蓽茇寧的含量較高，分別是1.93mg/g和1.82mg/g;印度和印度尼西亞產(chǎn)的

2、含量為0.8mg/g;中國海南產(chǎn)含量最低，為0.42mg/g。而胡椒中的草茇寧的含量更低，黑胡椒中蓽茇寧的平均含量僅為0.15mg/g。
　　由上述結(jié)果可知，從天然產(chǎn)物中提取蓽茇寧成本極高。繼而又進(jìn)行了蓽茇寧的化學(xué)合成，確定了最佳合成工藝并進(jìn)行了中試放大實(shí)驗(yàn)，合成了3個(gè)批次的GBN樣品。將合成的3批樣品作為降血脂候選化合物進(jìn)行了系統(tǒng)的質(zhì)量控制研究。
　　根據(jù)該化合物的合成路線及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，依照《中國藥典》2010版（二部）、《

3、化學(xué)藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和《一類化學(xué)藥質(zhì)量要求》，進(jìn)行了性狀、理化性質(zhì)、鑒別(TLC、UV、IR、HPLC)、雜質(zhì)檢查、含量測定以及穩(wěn)定性的研究，有關(guān)物質(zhì)檢查和含量測定方法采用高效液相色譜法，十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑色譜柱，乙腈-水(50∶50)為流動(dòng)相，檢測波長為338nm。建立的方法具有良好的專屬性，最小檢出量為1.5ng，含量測定方法在0.2～1.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.99994)。日內(nèi)和日間精密度平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(R

4、SD)分別為0.38％和0.89％。
　　首次發(fā)現(xiàn)GBN溶液對光極不穩(wěn)定，在4500Lux的光照箱中照射15分鐘后主成分峰被降解，產(chǎn)生另外3種降解物，經(jīng)LC-MS分析，證實(shí)與GBN共屬同分異構(gòu)體。為得到各異構(gòu)體化合物，將GBN配成一定濃度的溶液，放入光照箱(4500Lux)照射，誘導(dǎo)其產(chǎn)生異構(gòu)體，采用半制備高效液相色譜，通過梯度洗脫的方法，分離并收集得到了GBN及其另外2種異構(gòu)體的化合物。分離得到的化合物按保留時(shí)間先后分別命名為G

5、BN-P1，GBN-P2和GBN-P3;采用多種波譜技術(shù)，包括UV、MS、NMR(1H-NMR、13C-NMR、DEPT-13C-NMR、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC)等，確證了GBN-P1，GBN-P2和GBN-P3的結(jié)構(gòu)分別為N-異丁基-5-(3，4-亞甲雙氧苯基)-2E，4E-戊二烯酰胺（白色晶體）;N-異丁基-5-(3，4-亞甲雙氧苯基)-2Z，4E-戊二烯酰胺（白色晶體）;N-異丁基-5-(3，4-亞甲雙氧苯基)-2

6、E,4Z-戊二烯酰胺（灰白色晶體）。
　　為研究GBN的異構(gòu)體對生物活性是否有影響，用光照誘導(dǎo)產(chǎn)生50％異構(gòu)體的混合物(GBNiso-mix)與純GBN對比進(jìn)行了動(dòng)物降血脂藥效實(shí)驗(yàn)，采用大鼠高脂血癥(HLP)模型，研究異構(gòu)體對GBN降血脂活性的影響，結(jié)果表明Iso-mix高劑量組和低劑量組均可顯著降低HLP大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)，并呈劑量依賴性，與GBN的活性沒有顯著差異。
　　用MTT法通過HepG2細(xì)

7、胞對GBN3種異構(gòu)體進(jìn)行了細(xì)胞毒性的比較，以辛伐他汀和胡椒堿做為陽性對照，結(jié)果表明3種異構(gòu)體對HepG2細(xì)胞的毒性都很低，GBN-P2毒性顯著低于GBN-P2和GBN-P3，均顯著低于辛伐他汀和胡椒堿。GBN-P1，GBN-P2和GBN-P3的LC50分別是0.407mM，0.587mM，0.360mM;胡椒堿和辛伐他汀分別為0.192mM，0.102mM。
　　體外考察了GBN-P1，GBN-P2和GBN-P3對HepG2細(xì)胞脂

8、質(zhì)代謝相關(guān)蛋白，低密度脂蛋白受體(LDLR)基因表達(dá)的影響，用10μM濃度的GBN-P1，GBN-P2，GBN-P3以及陽性對照藥辛伐他汀處理HepG2細(xì)胞，以配藥溶劑處理細(xì)胞作為空白對照。三種異構(gòu)體均能不同程度上調(diào)HepG2細(xì)胞LDLR基因的表達(dá)，相互間沒有顯著差異。
　　采用脂多糖(LPS)和γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)聯(lián)合刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7建立體外炎癥模型，考察GBN及其異構(gòu)體對過量產(chǎn)生的

9、NO的抑制作用，并以辛伐他汀做陽性對照。結(jié)果表明，GBN-P1，GBN-P2，GBN-P3均能顯著抑制NO的產(chǎn)生，并呈劑量依賴關(guān)系。
　　本研究首次分離得到了GBN的另外2種同分異構(gòu)體，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)、體外毒性和活性的比較，明確了GBN順反異構(gòu)體之間毒性及降血脂活性沒有顯著差異，為GBN的成藥性評價(jià)提供有價(jià)值的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。以化學(xué)一類創(chuàng)新藥的要求建立了降血脂候選藥GBN的一套科學(xué)、合理的質(zhì)量控制方法，從而有