霍山石斛的分子分類、NO生理調(diào)節(jié)作用研究及FPS基因的克隆.pdf

1、石斛屬(Dendrobium)植物是蘭科多年生附生植物、兼性CAM植物,為名貴中藥材。其中近40種可以入藥,但不同種類石斛藥用成分及含量差異較大,藥理活性也不盡相同。傳統(tǒng)的系統(tǒng)分類和進(jìn)化研究,主要依據(jù)形態(tài)學(xué)和地理分布,得到的結(jié)論不一致,易引起爭論。目前,已有多種分子標(biāo)記方法應(yīng)用于石斛屬植物的遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究,但序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)分子標(biāo)記技術(shù)在該屬植物中的應(yīng)用鮮見報(bào)道。 霍山石斛（D.huoshanense）

2、是安徽省霍山縣的特有石斛,屬藥用石斛中的特級珍品,是國家重點(diǎn)保護(hù)的藥用植物和名貴中藥材。由于其生境獨(dú)特,繁殖困難,加之過度采收,野生資源己瀕臨絕跡。為增加其藥源,前人在霍山石斛人工栽培、組織培養(yǎng)快繁方面做了大量研究工作,但對其生理代謝的調(diào)控、關(guān)鍵酶基因的克隆以及利用基因工程的方法調(diào)節(jié)功能基因表達(dá)的研究較少。一氧化氮(nitric oxide,NO)作為植物體一種新的信號分子,參與植物許多生理代謝的調(diào)節(jié)和次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控,而且可以作為

3、脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵信使。但NO對霍山石斛這種兼性CAM植物生理代謝調(diào)節(jié)的研究未見報(bào)道。 本課題利用兩種分子標(biāo)記技術(shù)分析藥用石斛的遺傳多樣性及親緣關(guān)系,確立屬下分類系統(tǒng),為更好地開發(fā)利用藥用石斛資源奠定基礎(chǔ)。同時(shí),本課題以霍山石斛為材料,研究在逆境與非逆境條件下NO對霍山石斛的生理調(diào)節(jié)作用,為了解NO對兼性CAM植物生理代謝的調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。此外,本研究還通過基于同源性的RT-PCR方法,克隆霍山石斛倍半萜類物質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶法

4、呢基焦磷酸合酶基因(FPS),為進(jìn)一步利用基因工程調(diào)控霍山石斛生物堿合成提供基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.利用SRAP和RAPD兩種分子標(biāo)記技術(shù),研究霍山石斛與其它藥用石斛主要產(chǎn)區(qū)代表性石斛的親緣關(guān)系。試驗(yàn)以用36個(gè)RAPD引物和40個(gè)SRAP引物組合分別對9個(gè)供試石斛的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。RAPD引物共產(chǎn)生281條帶,多態(tài)性帶占87.09％,遺傳相似性系數(shù)在0.4942～0.7731之間；SRAP引物組合共產(chǎn)生1977條帶,

5、多態(tài)性帶占90.2％,遺傳相似性系數(shù)在0.3302～0.7892之間?；趦煞N標(biāo)記的聚類結(jié)果存在一定的差異,SRAP聚類結(jié)果能較好地體現(xiàn)供試品種的親緣關(guān)系、地域特性和樹型特點(diǎn),與傳統(tǒng)的基于形態(tài)特征建立的分類結(jié)果比較一致。相對而言,SRAP比RAPD可檢測到更高的遺傳變異、更大的標(biāo)記效率和較高的多樣性檢測能力。 2.以不同濃度的SNP處理霍山石斛野生苗和試管苗,研究外源NO對霍山石斛膜脂過氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響,篩選了0.1mmo

6、l·L-1和0.5mm01.L-1SNP作為霍山石斛野生苗的處理濃度,而0～751μmol·L-1SNP為霍山石斛試管苗的適宜處理濃度。進(jìn)一步研究表明: (1)強(qiáng)光脅迫下,0.1mmol·L-1SNP處理增強(qiáng)了霍山石斛野生苗的SOD、POD和CAT三種酶活,提高了抗氧化系統(tǒng)清除活性氧能力,膜脂過氧化程度減輕,緩解了強(qiáng)光的脅迫作用,而0.5mmol.L-ISNP處理后,霍山石斛的SOD、POD和CAT的活性降低,丙二醛含量升高,S

7、NP處理加劇了強(qiáng)光脅迫造成的氧化損傷。 (2)以SNP處理霍山石斛試管苗發(fā)現(xiàn),在0～50μmol·L-1SNP處理濃度間,隨著SNP濃度的提高,霍山石斛的葉綠素含量、可溶性蛋白、苯丙氨酸解氨酶活和生物堿含量均呈現(xiàn)出逐步的遞增,NO可誘導(dǎo)霍山石斛次生代謝產(chǎn)物的合成積累。作為誘導(dǎo)子,50μmol·L-1SNP是處理霍山石斛試管苗的適宜濃度。 3.總結(jié)了強(qiáng)光脅迫下霍山石斛光抑制的生理變化,研究了外源NO在光抑制及暗恢復(fù)中的作用

8、。試驗(yàn)采用"lake model"和"puddle model"兩種模式,對800μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下的霍山石斛葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行了測定。800μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下,霍山石斛的Fv/Fm、φpsⅡ、qP、qL、NPQ、φNPQ、ETR顯著下降,φNo顯著上升,PSⅡ反應(yīng)中心已不能通過有效調(diào)控對過剩光能進(jìn)行耗散,霍山石斛發(fā)生嚴(yán)重的光抑制：暗恢復(fù)24h后,霍山石斛的Fv/Fm、φpsⅡ、qP、qL、NPQ、φNPQ、ET

9、R上升,PSⅡ反應(yīng)中心逐漸恢復(fù)。通過兩種模式下葉綠素?zé)晒鈪?shù)的比較發(fā)現(xiàn),"lake model"更能簡單有效的反映霍山石斛的光能轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)。強(qiáng)光脅迫下,0.1mmol·L-1SNP處理提高了石斛PSⅡ的光能轉(zhuǎn)換效率和潛在活性,增加了過剩光能的非光化學(xué)耗散,緩解了光抑制的發(fā)生,有效保護(hù)了光合機(jī)構(gòu)免受強(qiáng)光脅迫的傷害,PSⅡ反應(yīng)中心得以較快恢復(fù)。而經(jīng)0.5mmol·L-1SNP處理后,霍山石斛的光能轉(zhuǎn)換系統(tǒng)未能通過有效的光能轉(zhuǎn)換和非光

10、化學(xué)反應(yīng)耗散過剩的光能,加劇了PSⅡ反應(yīng)中心光抑制的發(fā)生。 4.以霍山石斛為材料,根據(jù)在GenBank已登錄的其它植物法昵基焦磷酸合酶基因的氨基酸序列,設(shè)計(jì)簡并引物,利用RT-PCR技術(shù),克隆出了石斛FPS基因片段(GenBank登錄號:EU681273),sh-fps的cDNA序列長為522bp,編碼174個(gè)氨基酸。sh-fps推斷的氨基酸序列與多種植物FPS基因的氨基酸序列具有較高的同源性,同源性為79％-88％,且該基因片