霍山石斛生物鐘相關基因克隆及其與培養(yǎng)物糖含量分析.pdf

1、霍山石斛（Dendrobium huoshanense Tang et Cheng）是多年生蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.）植物，在中國傳統(tǒng)中藥里被譽為仙草之首，同時也具有觀賞價值。本研究對霍山石斛原球莖和試管苗的離體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化；對不同光周期培養(yǎng)條件下原球莖和試管苗的增殖率、器官發(fā)生和組織細胞形態(tài)結構以及多糖含量進行了觀察和測定；以原球莖和試管苗為材料，克隆了生物鐘中央振蕩器核心基因(CIRCA

2、DIAN CLOCK-ASSOCIATED1， CCA1)和與中央振蕩器相關的抗逆基因MYB1R1，對CCA1基因和MYB1R1基因進行不同光周期處理，并研究分析其定量表達結果，最終通過綜合研究離體培養(yǎng)條件下不同光周期、不同培養(yǎng)環(huán)境、增殖率、多糖含量及基因表達的關系，為揭示霍山石斛多糖代謝機理提供實驗生物學和分子生物學的理論和依據(jù)。
　　1.不同光周期條件下霍山石斛的增殖率?；羯绞蚯o培養(yǎng)于MS+NAA0.1mg/L+KT0.

3、05mg/L+土豆汁50 g/L培養(yǎng)基，試管苗培養(yǎng)于1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5 mg/L+香蕉汁200g/L培養(yǎng)基，比較了原球莖及試管苗在不同光周期處理下的增殖率。
　　試驗結果表明，不同光周期對原球莖增殖率有一定影響：在黑暗培養(yǎng)條件下最低；在24h、18h、12h、6h光照的光周期條件下培養(yǎng)50天時增殖率達到最高并具有相近的增殖率；其中以18小時光照在培養(yǎng)50天時增殖率達到最高；同時24小時光照條件下增殖率在

4、各培養(yǎng)時間段都表現(xiàn)出最高值并在培養(yǎng)40d時已經接近峰值。不同光周期對試管苗增殖率影響幅度較原球莖的?。蛔耘囵B(yǎng)10d后，以12h/12h L/D光照條件下增殖率領先，并保持最高。但總體上原球莖增殖率遠高于試管苗增殖率。
　　2.不同光周期培養(yǎng)條件下多糖含量的測定?；羯绞蚯o培養(yǎng)于MS+NAA0.1mg/L+KT0.05mg/L+土豆汁50 g/L培養(yǎng)基，試管苗培養(yǎng)于1/2MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L培養(yǎng)基

5、，比較原球莖及試管苗在不同光周期下的多糖含量。
　　試驗結果表明：6小時光照和全黑暗條件下多糖積累首先到達最高值，之后逐漸降低；其中以原球莖在6小時光照條件下培養(yǎng)10d多糖含量已達到峰值。24小時光照處理條件下的原球莖和試管苗多糖含量在培養(yǎng)30d時同樣達到高水平，之后逐漸降低；其中以試管苗在24小時光照處理下培養(yǎng)至30d達到峰值。培養(yǎng)40d及之后，各光周期條件均表現(xiàn)出多糖含量下降至接種時的多糖含量，說明在培養(yǎng)基養(yǎng)分接近消耗殆盡時（

6、40d-50d），無法繼續(xù)進行多糖積累，只能維持自身生長發(fā)育。不同光周期對試管苗的多糖含量較對原球莖的影響較大，在培養(yǎng)10d之后，光照的增加與多糖含量呈正相關。試管苗多糖積累水平均高于同期培養(yǎng)時間的原球莖，而原球莖的多糖積累早于試管苗的多糖積累。
　　3.CCA1基因和MYB1R1基因的克隆和生物信息學分析。以霍山石斛原球莖和試管苗為材料，結合同源克隆和RACE技術，首次獲得了霍山石斛CCA1基因和MYB1R1基因的cDNA全長：

7、CCA1基因cDNA全長為1652 bp，登錄號為KX710175；MYB1R1基因cDNA全長1332 bp，登錄號為KX710176。這2條基因的cDNA序列的開放閱讀框分別編碼532和427個氨基酸。通過對CCA1基因和MYB1R1基因進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)CCA1是堿性蛋白， MYB1R1是酸性蛋白，都不具有信號肽，也都不屬于分泌蛋白；其中CCA1和MYB1R1中均含有myb保守結構域，證明了CCA1與MYB1R1同屬于MYB轉

8、錄因子家族。
　　4.CCA1基因和MYB1R1基因定量表達分析。以Actin基因為內參基因，對CCA1基因和MYB1R1基因在原球莖和試管苗不同光周期處理下的表達水平進行定量表達分析。本實驗以接近自然晝夜周期的12小時光照為參照組，在培養(yǎng)第1d、10d、20d、30d、40d及50d時對材料進行基因定量表達分析。結果顯示：CCA1基因、MYB1R1基因在原球莖中的表達趨勢基本相同，在試管苗中的表達趨勢也基本相同。CCA1基因在原

9、球莖中一般先于MYB1R1基因出現(xiàn)表達波動，在試管苗中兩者則基本同步。CCA1基因、MYB1R1基因在原球莖的表達趨勢和試管苗中的表達趨勢都不相同。兩者在原球莖中的表達量高于試管苗中的表達量。根據(jù)長時間尺度基因表達的數(shù)據(jù)推測：MYB1R1基因具有部分生物鐘的節(jié)律功能，或是與生物鐘中央振蕩器直接作用的基因。
　　原球莖在培養(yǎng)第30d時，每隔6h對不同光周期處理材料取樣，以12小時光照為參照組，觀察CCA1基因和MYB1R1基因在24

10、h內的變化趨勢。結果顯示：CCA1基因在30d時已經全部偏離12h/12h光周期，出現(xiàn)不等振幅及不同光周期的現(xiàn)象；MYB1R1基因在培養(yǎng)第30d時與CCA1基因相比更接近原來的12h/12h光周期；MYB1R1基因在本實驗條件下也出現(xiàn)不等振幅及周期變化；MYB1R1基因與CCA1基因表達趨勢相近。根據(jù)短時間尺度基因表達的數(shù)據(jù)推測：MYB1R1基因可能具有部分生物鐘的節(jié)律功能，或是與生物鐘中央振蕩器直接作用的基因。
　　以18SrR

11、NA為參照，在半浸沒及干旱脅迫等條件下處理48小時，結果顯示MYB1R1基因在半浸沒及干旱處理條件下出現(xiàn)明顯表達變化，在黑暗條件下也出現(xiàn)高表達，說明MYB1R1基因與光照和干旱脅迫有關，可能參與干旱的信號傳導。
　　綜上所述，以CCA1基因為參照標志的光周期研究發(fā)現(xiàn)，光周期影響霍山石斛的多糖含量，以及增殖率和干物質含量；原球莖更適于光周期誘導的多糖含量調控。CCA1基因在原球莖中的上升表達早于在試管苗中的表達。CCA1基因在出現(xiàn)高

12、上調表達后，一般會導致各生理指標的提高。CCA1基因、MYB1R1基因在原球莖中表達的幅度大于在試管苗中的幅度，但CCA1基因和MYB1R1基因表達趨勢基本相似。在第30d的24h時間尺度上研究中發(fā)現(xiàn)，CCA1基因和MYB1R1基因在偏離半光照條件下出現(xiàn)時間偏離和表達不均衡。MYB1R1基因具有部分生物鐘的節(jié)律功能，并可能參與干旱信號傳導。本文在蘭科植物里第一次提供了MYB1R1基因參與光周期和干旱脅迫的表達研究數(shù)據(jù)。
　　5.同

13、步提取RNA和多糖的技術。以霍山石斛愈傷組織、愈傷組織和原球莖為材料，提取材料中RNA后，收集提取過程中的廢棄物進行多糖提取。結果顯示RNA提取質量符合基因表達研究的需要，而且提取的多糖可以與標準的多糖提取具有穩(wěn)定的對應關系，使原位并實時研究基因表達和多糖分析成為可能。
　　綜上所述，本研究改進了霍山石斛的離體培養(yǎng)條件，揭示了培養(yǎng)條件下霍山石斛培養(yǎng)物多糖含量的變化規(guī)律，克隆了生物鐘相關基因并進行生物信息學分析，在長時間尺度和短時間