新城疫病毒誘導(dǎo)人耐順鉑A549肺癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、順鉑(Cisplatin，DDP)是一種療效顯著的抗腫瘤藥物，對多種實體瘤均具有較好的臨床療效，因此被廣泛應(yīng)用于癌癥的化療。然而，腫瘤細(xì)胞極易對順鉑產(chǎn)生耐藥，常導(dǎo)致化療失敗，限制了順鉑的應(yīng)用。本實驗旨在研究新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)對人耐順鉑肺癌細(xì)胞(A549/DDP)的體內(nèi)外溶瘤作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。研究發(fā)現(xiàn)，NDV能特異而高效地在A549/DDP和A549細(xì)胞中增殖，且在A549/DDP細(xì)胞中的

2、增殖能力更強，但不能在正常細(xì)胞中復(fù)制。NDV通過激活capase依賴的細(xì)胞凋亡通路、MAPK通路和Akt通路誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的A549/DDP細(xì)胞凋亡，且對A549/DDP荷瘤裸鼠具有顯著的溶瘤效果。本實驗首次研究了NDV對耐藥肺癌細(xì)胞的溶瘤機制，結(jié)果表明溶瘤新城疫病毒在臨床治療順鉑耐藥肺癌中具有重要的應(yīng)用前景。取得的研究結(jié)果如下:
　　 1.采用TCID50法測定病毒滴度，結(jié)果表明NDV(FMW株)能特異而高效地在人耐順鉑肺癌細(xì)胞

3、(A549/DDP)中增殖，且較在其親本肺癌細(xì)胞(A549)中的增殖能力更強，但不能在MRC-5人胚肺成纖維細(xì)胞中增殖。
　　 2.FACS(AnnexinV/PI雙染法)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明FMW感染能夠誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡，該凋亡過程對于FMW感染具有時間依賴性。
　　 3.Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞核均呈彌散均勻的橢圓狀。FMW感染組部分細(xì)胞核切割成大小不等的致密濃染碎塊，

4、呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步顯示FMW感染引起A549/DDP細(xì)胞凋亡。
　　 4.WesternBlot檢測凋亡相關(guān)通路的活化，結(jié)果表明FMW感染激活caspase通路，其中caspase-8介導(dǎo)的外源性凋亡通路起主要作用，此外，MAPK通路和Akt通路也被激活。
　　 5.采用pan-caspase抑制劑Z-VAD-FMK(50μM)預(yù)處理A549/DDP細(xì)胞后再感染FMW，F(xiàn)ACS(AnnexinV/PI雙

5、染法)檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡被明顯抑制，表明FMW誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞凋亡依賴于caspase的激活。
　　 6.分別用Erk1/2、Jnk、p38和Akt通路特異性抑制劑PD98059(20μM)、SP600125(10μM)、SB203580(10μM)或LY294002(10μM)預(yù)處理細(xì)胞后再感染FMW，MTT法分析細(xì)胞殺傷率。結(jié)果顯示，抑制MAPK和Akt通路均能抑制FMW誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞凋亡，表明

6、MAPK和Akt通路參與該凋亡過程。
　　 7.H&E染色、TUNEL法分析荷瘤裸鼠腫瘤石蠟切片，發(fā)現(xiàn)未感染組細(xì)胞基本未見凋亡，而FMW感染組細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡特征，表明FMW能誘導(dǎo)A549/DDP或A549荷瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 8.采用QRT-PCR分析FMWM基因表達(dá)并以TCID50法測定病毒滴度，研究FMW在荷瘤裸鼠瘤內(nèi)復(fù)制能力。結(jié)果表明FMW能在A549/DDP或A549荷瘤裸鼠瘤內(nèi)特異地高效復(fù)制，且在A

7、549/DDP移植瘤中復(fù)制能力更強。
　　 9.測量并計算荷瘤裸鼠腫瘤體積，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)MW顯著抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長，對A549/DDP及A549移植瘤的抑瘤效果相近，且能夠延長荷瘤裸鼠生存期。
　　 本實驗首次研究了NDV對耐藥肺癌細(xì)胞的溶瘤作用，證明NDV通過激活caspase通路、MAPK通路和Akt通路而有效誘導(dǎo)耐順鉑肺癌細(xì)胞凋亡，較好地克服了順鉑耐藥導(dǎo)致的凋亡下調(diào)，對體外培養(yǎng)的A5