人野生型Mst1基因抑制腫瘤生長的實驗研究.pdf

1、哺乳動物不育系20樣激酶1(mammalian sterile20-like kinase1，Mst1)，又稱絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(serine/threonine-protein kinase4，STK4)和應(yīng)激應(yīng)答激酶2(kinase responsive to stress2，KR S2)，是果蠅Hippo基因在哺乳類中的同源基因，編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要參與細胞生長、增殖、凋亡以及器官大小等的調(diào)控，具有抑癌作用。

2、　　目的:
　　從分子、細胞及動物水平探討Mst1基因的抑癌作用及其部分的分子機理，模擬腫瘤的基因治療，旨在為腫瘤的基因治療進行一些有益的嘗試并提供有參考意義的實驗數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1、人野生型Mst1基因真核表達載體的構(gòu)建及鑒定
　　將Mst1 cDNA連接至真核表達載體pEGFP-N1中，用卡那霉素抗性篩選，菌落PCR及測序并序列比對對重組質(zhì)粒進行鑒定。
　　2、高表達Mst1基因?qū)θ烁伟┘毎鸋e

3、pG2作用的體外實驗研究
　　用PolyJetTM體外DNA轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2，應(yīng)用MTT比色法、流式細胞術(shù)及Hoechst33342染色法觀察高表達Mst1對細胞增殖與凋亡的影響;RT-qPCR檢測Mst1、CTGF、AREG和Survivin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，Western blot方法檢測MST1、YAP、Phospho-YAP(Ser127)和Caspase-3蛋白的表達情況

4、，初步探討Mst1基因在體外抑制細胞HepG2生長的分子機制。另外，我們將MTT比色法、流式細胞術(shù)與Western blot方法相結(jié)合，初步探討MST1蛋白的表達和活化與DDP誘導(dǎo)細胞死亡的關(guān)系。
　　3、高表達Mst1基因?qū)θ朔切〖毎伟┥L影響的實驗研究
　　用pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人非小細胞肺癌細胞A549，初步分析細胞凋亡情況及MST1、YAP、Phospho-YAP(Ser127)蛋白和Mst1、CTGF、

5、AREG和SurvivinmRNA的表達水平。用Mst1基因?qū)549細胞形成的裸鼠移植瘤進行模擬基因治療，觀察移植瘤的生長情況，并用免疫組織化學分析移植瘤中YAP及Phospho-YAP(Ser127)蛋白的表達，初步探討Mst1基因抑制腫瘤生長的分子機制。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)菌落PCR、序列測定及比對結(jié)果顯示成功構(gòu)建了人野生型Mst1基因真核表達載體pEGFP-N1-Mst1。
　　2、用PolyJetTM體外

6、DNA轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2，細胞生長抑制率及細胞凋亡率明顯升高，且抑制率隨處理時間的增加而升高，并且上調(diào)MST1的活性片段MST1(amino terminal truncated form，NT)、Caspase-3的活性片段Caspase-3(cleavage，CL)和YAP的磷酸化形式Phospho-YAP(Ser127)水平，顯著下調(diào)CTGF、AREG和Survivin mRNA表達水平

7、，DDP的干預(yù)具有促進MST1功能的效果。經(jīng)DDP干預(yù)， HepG2-MST1細胞的增殖活性顯著低于HepG2-Vect細胞(P＜0.05），細胞凋亡率顯著高于HepG2-Vect細胞(P＜0.05），HepG2細胞中MST1(NT)和Phospho-YAP(Ser127)的水平都隨DDP干預(yù)時間的延長而逐漸升高，但MST1和YAP蛋白總量并沒有改變。
　　3、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Mst1的A549細胞凋亡率升高，細胞中MST1

8、(NT)和Phospho-YAP(Ser127)水平升高，CTGF、AREG和Survivin mRNA表達水平下降。應(yīng)用Mst1基因、DDP和Mst1基因聯(lián)合DDP的3個治療組在27天后的平均瘤塊體積和重量均顯著低于Control和陰性對照組(P＜0.01)，平均抑瘤率分別為(32.30±1.87)％、(51.77±3.98)％和(73.01±1.22)％，并伴隨著YAP蛋白的胞核陽性的降低，YAP和Phospho-YAP(Ser12

9、7)蛋白的胞漿陽性的升高。
　　結(jié)論:
　　1、高表達Mst1基因促進HepG2細胞和A549細胞凋亡;
　　2、高表達Mst1基因上調(diào)腫瘤細胞中MST1(NT)、Caspase-3(CL)和Phospho-YAP(Ser127)蛋白的表達水平，下調(diào)CTGF、AREG和Survivin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，這可能是高表達Mst1基因抑制腫瘤生長的分子機制之一;
　　3、高表達Mst1能夠增強HepG2細胞對DDP