PEDF抑制腫瘤血管增生和腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、血管增生(angiogenesis，neovacularization)，即從已存在的毛細(xì)血管網(wǎng)上大量生成新生血管的過(guò)程。血管增生受血管增生促進(jìn)因子和血管增生抑制因子調(diào)節(jié)，二者之間的失衡是包括腫瘤在內(nèi)的病理性血管增生的病因。血管增生促進(jìn)因子的表達(dá)上調(diào)和血管增生抑制因子的表達(dá)下降均能誘發(fā)血管增生，而且二者常常同時(shí)發(fā)生。 腫瘤的生長(zhǎng)依賴于血管增生。腫瘤在新生血管長(zhǎng)入前生長(zhǎng)緩慢，一旦新生血管長(zhǎng)入腫瘤即呈快速生長(zhǎng)狀態(tài)。而且，腫瘤細(xì)胞由新

2、生血管進(jìn)入血液循環(huán)是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的第一步。腫瘤血管增生對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移是最重要的因素。因此，以腫瘤血管增生為靶點(diǎn)正成為治療包括惡性腫瘤在內(nèi)的血管增生性疾病的研究熱點(diǎn)。 色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderived-factor，PEDF)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)上均顯示是一種強(qiáng)的血管增生抑制因子。文獻(xiàn)報(bào)道PEDF作用較其它的已知的血管增生抑制因子都要強(qiáng)，是目前已知的活性最強(qiáng)的血管增生抑制因子。PEDF能抑制

3、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移以及低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管增生，而對(duì)于腫瘤生物治療的實(shí)驗(yàn)研究還處于起步階段。 1.研究目的：由于直接從人體中分離純化PEDF難度較大，因此本研究采用基因克隆和重組表達(dá)技術(shù)，在原核表達(dá)載體pET22b、pET28a和pET30a中構(gòu)建表達(dá)人PEDF，優(yōu)化表達(dá)和純化條件，以期獲得具有生物學(xué)活性的重組人PEDF的高效表達(dá)；建立裸鼠腫瘤皮下種植模型，觀察rPEDF在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)于腫瘤的影響，探索尋找治療腫瘤的新手

4、段和新策略。 2.研究方法：①根據(jù)已知的GeneBank中人PEDFcDNA成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列(AF400442，nt128-nt1327)設(shè)計(jì)特異性引物，以人視網(wǎng)膜cDNA文庫(kù)為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增人PEDF基因，定向克隆至原核表達(dá)載體pET-22b中；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)以建立表達(dá)人PEDF重組融合蛋白的工程菌株；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)PEDF，經(jīng)變性復(fù)性后獲得可溶性重組蛋白；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定其活性。②以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET

5、22b/PEDF為模板，PCR擴(kuò)增人PEDF基因，定向克隆至原核表達(dá)載體pET28a和pET30a中；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)以建立表達(dá)人PEDF重組融合蛋白的工程菌株；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)PEDF，可直接獲得可溶性重組蛋白；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定其活性。③MTT法檢測(cè)rPEDF對(duì)人胃癌細(xì)胞系細(xì)胞SGC7901、人宮頸癌細(xì)胞系細(xì)胞HeLa和人鼻咽癌細(xì)胞系細(xì)胞CNE-2增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)rPEDF對(duì)SGC7901、HeLa和CNE-2細(xì)胞

6、凋亡的影響。④建立裸鼠腫瘤皮下種植模型；檢測(cè)rPEDF對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響；繪制生長(zhǎng)曲線，測(cè)量瘤重，計(jì)算抑瘤率。 3.研究結(jié)果：①PCR、酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果表明：本研究成功構(gòu)建了人PEDFcDNA成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列的原核表達(dá)載體pET22b/PEDF，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，經(jīng)變性復(fù)性可獲得可溶性PEDF，產(chǎn)量約為每升10mg；重組人PEDF能細(xì)胞特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，證實(shí)其具有天然蛋白質(zhì)的活性。

7、②PCR、酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果表明：本研究成功構(gòu)建了人PEDFcDNA成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列的原核表達(dá)載體pET28a/PEDF和pET30a/PEDF，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，可直接獲得可溶性PEDF，產(chǎn)量約為每升12mg；重組人PEDF能細(xì)胞特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。③rPEDF對(duì)人胃癌細(xì)胞系細(xì)胞SGC7901和人宮頸癌細(xì)胞系細(xì)胞HeLa的增殖和凋亡無(wú)影響。rPEDF抑制人鼻咽癌細(xì)胞系細(xì)胞CNE-2細(xì)胞的增

8、殖，其抑制作用隨著rPEDF濃度的增加而增大，呈明顯的濃度依賴關(guān)系，EC50約為600nmol/L。rPEDF促進(jìn)CNE-2細(xì)胞的凋亡，且隨著rPEDF濃度的增加而增大，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。④動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PEDF具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。 4.結(jié)論：①獲得了可以表達(dá)人PEDFeDNA成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列的大腸桿菌工程菌株：pET22b/PEDF-BL21(DE3)，建立了從不溶性包涵體中獲得具有生物學(xué)活性的可溶性重組蛋白的方法

9、。②獲得了可以表達(dá)人PEDFeDNA成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列的大腸桿菌工程菌株：pET28a/PEDF-BL21(DE3)和pET30a/PEDF-BL21(DE3)，建立了從可溶上清中獲得具有生物學(xué)活性的可溶性重組蛋白的方法。③rPEDF具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能，其作用是通過(guò)兩個(gè)環(huán)節(jié)起作用的：1)它通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，阻止腫瘤新生血管生成從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。2)它也通過(guò)抑制部分腫瘤細(xì)胞(鼻咽癌細(xì)胞)的增殖，促