銅綠假單胞菌生物膜與藻酸鹽相關(guān)基因研究.pdf

1、銅綠假單胞菌是造成我國(guó)醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染及重癥監(jiān)護(hù)病房感染最主要的非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，耐藥性強(qiáng)，臨床治療棘手。隨著各種侵入性醫(yī)療器械的廣泛應(yīng)用，由銅綠假單胞菌生物膜造成的醫(yī)用材料相關(guān)感染的難治性已被臨床廣泛關(guān)注，而由銅綠假單胞菌引起的慢性難治性下呼吸道感染也與生物膜形成密切相關(guān)。細(xì)菌生物膜是指附著在有生命或無生命物體表面的由細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外多聚基質(zhì)包裹的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)群體，它是細(xì)菌的一種具有自我保護(hù)性的生長(zhǎng)模式。與浮游細(xì)菌相比，生物

2、膜細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抗性可提高10～1000倍，現(xiàn)有藥物難以清除生物膜。生物膜細(xì)菌高度耐藥的機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為是多個(gè)因素的綜合作用造成的，包括細(xì)菌胞外多聚基質(zhì)的屏障作用、生物膜細(xì)菌生理上的不均質(zhì)性及生物膜結(jié)構(gòu)上的不均質(zhì)性。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的胞外多聚基質(zhì)主要包含胞外多糖、蛋白質(zhì)和DNA，其中胞外多糖的重要成分——藻酸鹽在其生物膜形成和結(jié)構(gòu)方面的作用還存在爭(zhēng)議。以往的研究認(rèn)為藻酸鹽在銅綠假單胞菌生物膜形成和結(jié)構(gòu)方面具有重要作用，但最近Wo

3、zniak等人提出藻酸鹽不是非黏液型銅綠假單胞菌生物膜胞外多聚基質(zhì)的主要成分，對(duì)其生物膜形成和結(jié)構(gòu)不起作用；而Stapper等人則認(rèn)為藻酸鹽對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成和結(jié)構(gòu)有一定影響但非決定因素。由于各研究組所采用的實(shí)驗(yàn)方法具有差異，結(jié)果難以對(duì)比，目前對(duì)這一問題尚無定論。亞胺培南/西司他丁(泰能)是臨床治療重癥感染經(jīng)驗(yàn)用藥的首選抗生素之一，最近有報(bào)道指出亞胺培南/西司他丁可誘導(dǎo)非黏液型銅綠假單胞菌PAO1藻酸鹽合成增加，促進(jìn)其生物膜形成和

4、加厚，對(duì)亞胺培南/西司他丁在銅綠假單胞菌重癥感染并有合并生物膜感染可能時(shí)的應(yīng)用提出了疑問。對(duì)抗生物膜感染的方法除了研發(fā)新的抗生素外，從生物膜形成的各個(gè)階段著眼來阻止生物膜形成是目前研究的熱點(diǎn)，最近的研究表明胞外多聚基質(zhì)中的DNA成分為細(xì)菌生物膜形成所必需。本課題關(guān)注的問題包括：1)藻酸鹽對(duì)黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌生物膜形成和結(jié)構(gòu)的影響；2)亞胺培南/西司他丁(泰能)能否在銅綠假單胞菌重癥感染并有合并生物膜感染可能時(shí)使用；3)從抑制胞

5、外多聚基質(zhì)中的DNA成分著手尋找新的治療銅綠假單胞菌生物膜感染的途徑。本課題以黏液型銅綠假單胞菌PA17和非黏液型銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1為研究對(duì)象，對(duì)以上三方面的問題進(jìn)行了研究。 目的:研究藻酸鹽對(duì)黏液型銅綠假單胞菌PA17和非黏液型銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成和結(jié)構(gòu)的影響；觀察亞胺培南/西司他丁(泰能)對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成及藻酸鹽合成相關(guān)基因algD表達(dá)的影響，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；檢測(cè)DNaseI對(duì)銅綠假單胞菌

6、生物膜形成和成熟生物膜的影響，為臨床治療銅綠假單胞菌生物膜感染提供新思路。 方法:改良平板培養(yǎng)法建立黏液型銅綠假單胞菌PA17和非黏液型銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1的體外生物膜模型；半定量RT-PCR方法檢測(cè)浮游狀態(tài)和生物膜形成不同時(shí)間點(diǎn)PA17和PAO1的藻酸鹽合成相關(guān)基因algD、algU和algR的表達(dá)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；PCR方法擴(kuò)增PA17和PAO1的藻酸鹽合成調(diào)節(jié)基因mucA全序列并測(cè)序比較；克隆PAO1的野生型muc

7、A基因并轉(zhuǎn)入PA17中表達(dá)，觀察表達(dá)野生型mucA基因的PA17的algD表達(dá)和生物膜形成過程；液體稀釋法檢測(cè)PA17和PAO1對(duì)常用抗菌藥物的最低抑菌濃度；掃描電鏡觀察1倍和10倍最低抑菌濃度的亞胺培南/西司他丁對(duì)PA17和PAO1生物膜形成的影響；半定量RT-PCR方法檢測(cè)干預(yù)過程中不同時(shí)間點(diǎn)PA17和PAO1的藻酸鹽相關(guān)基因algD的表達(dá)情況；掃描電鏡觀察不同濃度DNaseI對(duì)PA17和PAO1生物膜形成及成熟生物膜的影響。

8、 結(jié)果:PA17于第6天形成成熟生物膜，PAO1于第3天形成成熟生物膜，兩者結(jié)構(gòu)均為薄膜狀。浮游狀態(tài)時(shí)，PA17的algD、algU和algR表達(dá)均較PAO1高，t檢驗(yàn)顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生物膜形成過程中algD和algU均在成熟生物膜形成時(shí)表達(dá)最高，algR在生物膜形成的第24h表達(dá)最高。單因素方差分析結(jié)果顯示生物膜形成的不同時(shí)間點(diǎn)algD、algU和algR表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)顯示生物膜形成過程中PAO

9、1和PA17間上述基因表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PA17的mucA基因第166-333位核苷酸缺失，第342位A→G；PAO1的mucA基因序列與Genebank中公布的序列完全相同?？寺AO1的mucA基因并轉(zhuǎn)入PA17中表達(dá)，表達(dá)重組質(zhì)粒PA17浮游狀態(tài)的algD表達(dá)下降，其生物膜形成速度居PAO1和PA17之間，8h時(shí)即可出現(xiàn)不可逆性黏附，與PAO1相同，成熟生物膜形態(tài)為薄膜狀。對(duì)PA17用1倍和10倍最低抑菌濃度的亞胺培南/西司

10、他丁干預(yù)時(shí)，第3dalgD表達(dá)較未干預(yù)組分別增加1.5和3.4倍，生物膜形態(tài)無明顯變化；第6dalgD表達(dá)分別增加0.38和0.78倍，PA17分散的黏附于蓋玻片，沒有形成生物膜。對(duì)PAO1用1倍和10倍最低抑菌濃度的亞胺培南/西司他丁干預(yù)時(shí)，第24halgD表達(dá)較未干預(yù)組分別增加2.5和3.5倍，生物膜形態(tài)無明顯變化；第3d分別增加0.7和2.1倍，1倍最低抑菌濃度亞胺培南/西司他丁作用組仍可看到少量微菌落存在，10倍最低抑菌濃度作用

11、組僅見散在的細(xì)菌；第6d分別增加1.5和2.1倍，兩個(gè)濃度組均只見數(shù)個(gè)細(xì)菌黏附于蓋玻片。25U/ml的DNaseI即可抑制黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌生物膜形成且分解成熟生物膜，100U/ml的DNaseI可完全阻止其生物膜形成并徹底分解成熟生物膜。 結(jié)論:藻酸鹽主要在生物膜形成過程中微菌落分化為成熟生物膜的階段發(fā)揮作用，但不是決定性因素；黏液型銅綠假單胞菌PA17和非黏液型銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1的生物膜結(jié)構(gòu)均為薄膜狀可能

12、與PA17和PAO1生物膜形成過程中藻酸鹽合成相關(guān)基因表達(dá)水平接近相關(guān)；PA17含新型mucA基因突變，這種新突變類型的mucA基因與PAO1的野生型mucA基因?qū)︺~綠假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響一致；野生型mucA基因不僅參與藻酸鹽合成，還可增強(qiáng)生物膜形成初期細(xì)菌的不可逆黏附能力，而PA17的新型mucA基因突變可減弱該能力；亞胺培南/西司他丁雖可誘導(dǎo)algD表達(dá)上調(diào)從而使銅綠假單胞菌藻酸鹽合成增加，但若從生物膜形成早期開始使用，仍可抑制