NtGNL2基因的克隆及在煙草花粉發(fā)育中的功能分析.pdf

1、花粉萌發(fā)及花粉管生長是被子植物完成雙受精，世代繁衍的基礎(chǔ);同時，雙受精也是植物種子儲備能源物質(zhì)的先決條件，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)意義重大。花粉管的生長是極具代表性的極性生長模式，是極性生長以及細(xì)胞學(xué)研究的重要材料。對花粉管形態(tài)建成的研究主要集中在囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞骨架兩個方面。一般認(rèn)為囊泡運(yùn)輸為花粉管生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而細(xì)胞骨架則是囊泡在運(yùn)輸過程中正確定位的保證。在花粉管不同的形態(tài)部位，囊泡的類型和功能以及細(xì)胞骨架的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，而且兩者呈現(xiàn)

2、一定的相關(guān)性。研究表明，囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞骨架是花粉管極性生長的主要原因。
　　ARF-GEFs家族基因是花粉管極性生長的研究熱點。對擬南芥和煙草的相關(guān)研究表明在花粉發(fā)育中，該家族基因?qū)δ遗葸\(yùn)輸和細(xì)胞骨架起著重要的調(diào)控作用。ARF-GEFs有多個亞家族，而在植物中以GBF亞家族為典型代表。本研究中的NtGNL2是繼NtGNL1之后，又一個在煙草中克隆獲得的GBF家族成員。GBF亞家族成員在植物中僅有GNOM、GNL1和GNL2三個，其

3、中又以NL2的相關(guān)報導(dǎo)最少。本研究克隆獲得了煙草NtGNL2基因，并初步分析了NtGNL2在花粉發(fā)育過程中的功能。
　　1、以擬南芥AtGNL2和番茄SlGNL2基因為主要參考，通過同源克隆獲得NtGNL2基因包括起始密碼子在內(nèi)的特異序列。采用3'Race技術(shù)，設(shè)計接頭引物和特異引物，克隆獲得NtGNL2基因的3'UTR序列。拼接后的NtGNL2是大型ARF-GEF成員，與多個植物GNL2具有較高的同源性。
　　2、ARF-

4、GEFs家族基因的序列結(jié)構(gòu)及功能都高度保守。為了驗證新獲得的NtGNL2基因的保守性，通過同源比對和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析了NtGNL2與其它多個植物GBF家族成員的親緣關(guān)系，同時對彼此之間各個保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了蛋白序列的分析。同源比對和不同算法獲得的進(jìn)化樹顯示NtGNL2與GNOM及GNL1相關(guān)基因的親緣關(guān)系較多樣化，但NtGNL2依然具有其它植物GBF成員的高度保守位點。
　　3、結(jié)合半定量和定量檢測方法，分析了NtGNL2在煙草根、

5、莖、葉、花粉和花粉管之間的表達(dá)模式。結(jié)果顯示NtGNL2在煙草的花粉和花粉管中有顯著的高表達(dá)，而在其它組織中的表達(dá)極其微量。推測NtGNL2是花粉發(fā)育特異表達(dá)基因，在花粉萌發(fā)和延伸過程中發(fā)揮重要作用。
　　4、利用VIGS技術(shù)探究NtGNL2基因在花粉發(fā)育中的功能。針對NtGNL2構(gòu)建病毒誘導(dǎo)沉默載體，并通過農(nóng)桿菌注射侵染本氏煙后，半定量檢測NtGNL2在花粉中的表達(dá)量。結(jié)果表明本氏煙經(jīng)侵染后，目的基因在花粉中的表達(dá)下調(diào)。隨后觀察