CD133原核表達(dá)、純化和初步鑒定.pdf

1、目的:制備CD133特異性抗原用于篩選CD133噬菌體單鏈抗體文庫,使篩選產(chǎn)物能多與腫瘤干細(xì)胞表面的CD133抗原結(jié)合以達(dá)到靶向治療的目的。
　　 方法:用PCR擴(kuò)增CD133第二、三兩段胞外區(qū),分別將擴(kuò)增的兩段片段與pGEX4T-1(6*HIS)質(zhì)粒連接,酶切鑒定后測(cè)序驗(yàn)證。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中并誘導(dǎo)表達(dá),挑取單克隆培養(yǎng)后再經(jīng)酶切鑒定并測(cè)序驗(yàn)證。取構(gòu)建成功的基因工程菌株于1000ml氨芐-LB培養(yǎng)液中生長(zhǎng),0.

2、4 mM IPTG37℃誘導(dǎo)過夜表達(dá)后,超聲裂解蛋白,取周質(zhì)和包涵體蛋白分別進(jìn)行12％的SDS-PAGE凝膠電泳,隨后以考馬斯亮藍(lán)染色,選擇表達(dá)目的蛋白的菌株進(jìn)一步大量表達(dá),鎳柱純化。間接ELISA法鑒定目的抗原的特異性。
　　 結(jié)果:(1)將CD133分子二、三兩段胞外區(qū)PCR擴(kuò)增后瓊脂凝膠電泳,在750bp處可見兩條亮帶與理論值符合相符,證明擴(kuò)增成功；(2)第二、第三胞外區(qū)-pGEX4T-1目的基因雙酶切鑒定,1％瓊脂糖凝膠

3、電泳顯示在750bp處均可見插入的目的片段,序列檢測(cè)表明插入片段無突變。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)蛋白,經(jīng)超聲破碎,將上清和沉淀分別進(jìn)行12％的SDS-PAGE凝膠電泳,目的蛋白在沉淀中表達(dá)量較多,說明目的蛋白主要表達(dá)在包涵體中；(3)經(jīng)間接ELISA初步鑒定表明純化后的第二、三CD133胞外片段蛋白與CD133抗體有特異性的結(jié)合。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建CD133胞外片段2及3的重組質(zhì)粒,原核表達(dá)并純化獲得CD133胞外結(jié)構(gòu)域2蛋白及