腫瘤靶向性TRAIL基因表達(dá)載體抗乳腺癌的體外研究.pdf

1、研究目的： 通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)hTERT啟動(dòng)子在端粒酶陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR中的腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄活性；運(yùn)用基因重組技術(shù)構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子和SV40增強(qiáng)子調(diào)控的TRAIL基因表達(dá)載體phTERT-TRAIL，并通過(guò)RT-PCR、Westernblotting、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的方法檢測(cè)其在MCF-7/ADR細(xì)胞中的腫瘤特異性表達(dá)，及通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、FCM的PI染色法和AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)

2、其特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的情況。 研究方法： 1.hTERT啟動(dòng)子靶向性轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) 以pRL-TK質(zhì)粒作為內(nèi)參照，將其與hTERT啟動(dòng)子啟動(dòng)的熒光素酶基因報(bào)告質(zhì)粒phTERTluc1、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Control及陰性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic分別共轉(zhuǎn)染端粒酶陽(yáng)性的MCF-7/ADR細(xì)胞和端粒酶陰性的HELF細(xì)胞。利用雙熒光素酶測(cè)試系統(tǒng)，驗(yàn)證hTERT啟動(dòng)子在端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞中的特異性轉(zhuǎn)錄活性。

3、 2.構(gòu)建重組載體phTERT-TRAIL和陽(yáng)性對(duì)照載體pSV40-TRAIL 2.1引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增目的基因TRAIL 設(shè)計(jì)包含HindⅢ和NheⅠ酶切位點(diǎn)的TRAIL特異性引物，以pEGFP-TRAIL為模版，PCR擴(kuò)增可編碼膜結(jié)合型TRAIL的長(zhǎng)度為862bp的基因片段(含酶切位點(diǎn))。 2.2構(gòu)建重組載體phTERT-TRAIL和陽(yáng)性對(duì)照載體pSV40-TRAIL 將TRAIL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)

4、物經(jīng)HindⅢ和NheⅠ酶切、回收后，連接入經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ(NheⅠ的同尾酶)酶切的phTERTluc1中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，LA平板篩選挑取陽(yáng)性重組子，并經(jīng)酶切、測(cè)序、BLAST同源性分析進(jìn)行鑒定。phTERT-TRAIL經(jīng)HindⅢ和BamHI酶切獲得帶有TRAIL基因的片段，將其連接入帶有強(qiáng)啟動(dòng)子SV40的pGL3-Control后獲得陽(yáng)性對(duì)照載體pSV40-TRAIL。 3.脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染率的檢測(cè)

5、 將帶有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pEGFP-C3經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞和HELF細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞的24h轉(zhuǎn)染效率。 4.hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的TRAIL基因靶向MCF-7/ADR細(xì)胞表達(dá)的檢測(cè) 設(shè)立未轉(zhuǎn)染組(陰性對(duì)照組)、phTERTluc1轉(zhuǎn)染組(空載體對(duì)照組)、pSV40-TRAIL轉(zhuǎn)染組(陽(yáng)性對(duì)照載體組)和phTERT-TRAIL轉(zhuǎn)染組(實(shí)驗(yàn)組)四個(gè)組，分別檢測(cè)

6、各組細(xì)胞TRAIL的表達(dá)情況。 4.1半定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞TRAILmRNA水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48h，收集各組2×106個(gè)細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增TRAIL基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(含EB)電泳、拍照，光密度分析軟件半定量測(cè)定各組細(xì)胞TRAIL基因的表達(dá)情況。 4.2Westernblotting檢測(cè)各組細(xì)胞TRAIL蛋白水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48h，收

7、集各組5×106個(gè)細(xì)胞，以含1mmoL/LPMSF的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜，經(jīng)TRAIL特異性一抗、相應(yīng)二抗孵育后，DAB顯色分析各組細(xì)胞中TRAIL蛋白的表達(dá)情況。 4.3FCM檢測(cè)各組細(xì)胞TRAIL蛋白水平的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后48h的各組1×106個(gè)細(xì)胞，與TRAIL特異性一抗、相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗孵育后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞TRAIL蛋白的表達(dá)水

8、平。 5.hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的TRAIL基因特異性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24、48h光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，拍攝照片。 收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，分別采用FCM的PI染色法、AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)。 結(jié)果： 1.hTERT啟動(dòng)子在的MCF-7/ADR細(xì)胞中具有明顯特異的轉(zhuǎn)錄活性 雙熒光素酶試驗(yàn)證實(shí)hTERT啟動(dòng)子在端粒酶陽(yáng)性的MCF-7/ADR細(xì)胞中具有明顯轉(zhuǎn)

9、錄活性，在端粒酶陰性的HELF細(xì)胞中則不能有效激活。 2.成功構(gòu)建重組載體phTERT-TRAIL和陽(yáng)性對(duì)照載體pSV40-TRAIL 陽(yáng)性重組子質(zhì)粒抽提后分別進(jìn)行酶切鑒定、DNA測(cè)序及BLAST搜索分析鑒定，證明重組載體phTERT-TRAIL和pSV40-TRAIL構(gòu)建成功。 3.脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染率 將質(zhì)粒pEGFP-C3經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR和HELF細(xì)胞24h后，熒光顯微鏡下觀察，

10、顯示大約70％的MCF-7/ADR細(xì)胞和40％的HELF細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較強(qiáng)的綠色熒光；FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染率的結(jié)果顯示：MCF-7/ADR和HELF細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率分別為72.6％、42％。說(shuō)明脂質(zhì)體可有效介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染入這兩種細(xì)胞。 4.phTERT-TRAIL在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR中特異性表達(dá) 半定量RT-PCR、Westernblotting及FCM結(jié)果均顯示phTERT-TRAIL在MCF-7/ADR細(xì)胞中有特異

11、性高水平表達(dá)，而在HELF細(xì)胞中僅見(jiàn)極低水平表達(dá)。 5.phTERT-TRAIL誘導(dǎo)的靶向MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡 光鏡下形態(tài)學(xué)觀察、FCM的PI染色法和AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法的檢測(cè)結(jié)果均顯示，phTERT-TRAIL重組載體可有效誘導(dǎo)MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡，而對(duì)HELF細(xì)胞無(wú)誘導(dǎo)凋亡活性。 結(jié)論及意義： 首次構(gòu)建了體外靶向表達(dá)于端粒酶陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR并特異性誘