SPARC對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用SYBR熒光實時定量RT-PCR法檢測富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白（SPARC）對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞I型膠原蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：①成纖維細(xì)胞體外原代培養(yǎng):手術(shù)取4例增生性瘢痕（hypertrophic scar)（上肢、下肢、腹部、后背各一例），兩例來自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)病例，兩例來自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科手術(shù)病例。按文獻(xiàn)方法進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后傳代，實驗所用細(xì)胞均

2、為處于3-5代對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞。②將不同濃度重組人SPARC(終濃度為2.5、5、10pmol·L-1)對3-5代增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分別進(jìn)行干預(yù)3h。用Trizol試劑提取成纖維細(xì)胞總RNA，核酸測定儀測OD值，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA-20℃保存。稀釋cDNA成5個梯度(104、103、102、101、100)，分別進(jìn)行靶基因collagen type I及內(nèi)參基因β-actin的SYBR G

3、reen I實時定量PCR反應(yīng)，制備兩組基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測擴增效率。③將PCR產(chǎn)物作熔解曲線分析，并進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，確定產(chǎn)物特異性。Collagen type I mRNA相對表達(dá)量采用Comparative Delta-delta Ct法進(jìn)行分析。④各組均數(shù)之間比較采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析及兩兩比較的t檢驗。
　　 結(jié)果：４例增生性瘢痕標(biāo)本原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞成活良好，傳至３-５代用于實驗，用不同濃度

4、SPARC作用3h后，終止培養(yǎng)，進(jìn)入結(jié)果分析。①提取的總RNA進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，確定產(chǎn)物特異性，結(jié)果顯示提取的總RNA質(zhì)量純，無明顯降解，可以進(jìn)行下一步的RT-PCR反應(yīng)。②將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)95℃ 10s變性,然后95℃ 5s，60℃ 30s重復(fù)50個循環(huán)進(jìn)行擴增，用Rotor Gene3000系統(tǒng)Comparative Delta-delta Ct法進(jìn)行分析，結(jié)果與空白對照組相比，SPARC2.5pmol·L-1、5pmol·L-

5、1、SPARC10.0pmol·L-1實驗組collagen type I mRNA表達(dá)量分別增加1.5、3.4、3.9倍。③各組均數(shù)之間比較采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析及兩兩比較的t檢驗(P<0.05)，顯示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。④將PCR產(chǎn)物作熔解曲線分析，結(jié)果顯示collagen type I及β-actin基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值分別為85℃及89℃，熔解溫度均一，為單一銳利主峰，說明無引物二聚體及非特異性擴增，