正、反義VEGF基因轉(zhuǎn)染對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖行為的影響.pdf

1、【目的】應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建含靶基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的pcDNA3.1(+/-)重組質(zhì)粒，通過其轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，并運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)和MTT對轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行檢測，以探討正、反義血管內(nèi)皮生長因子基因?qū)θ嗽錾择：鄢衫w維細(xì)胞增殖行為的影響。
　　 【方法】采用組織塊法獲取人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，行鼠抗人細(xì)胞角蛋白(CK7)和波形

2、蛋白(V9)細(xì)胞免疫化學(xué)進(jìn)行鑒定。構(gòu)建靶向VEGF基因pcDNA3.1(+)/hVEGF165(正義組)、pcDNA3.1(-)/hVEGF165(反義組)和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)(空載體組)轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞，以及未行轉(zhuǎn)染處理的人成纖維細(xì)胞(對照組)，共設(shè)為4組。經(jīng)G418篩選獲得陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)顯示VEGF基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，上清行酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)檢測VEGF蛋白表達(dá)水平

3、，MTT測定細(xì)胞體外生長情況。
　　 【結(jié)果】(1)組織塊法成功獲取人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，并行CK7和V9細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定，成纖維細(xì)胞純度達(dá)90％以上。
　　 (2)經(jīng)酶切鑒定及測序證實(shí)，正、反義VEGF基因表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/hVEGF165和pcDNA3.1(-)/hVEGF165構(gòu)建成功。
　　 (3)G418篩選成纖維細(xì)胞的最佳濃度為200μg/mL，50μg/mL為細(xì)胞擴(kuò)增濃度。
　

4、　 (4)正、反義VEGF及空載體pcDNA3.1(+)經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)均成功轉(zhuǎn)染至人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中，G418篩選培養(yǎng)其抗性克隆，并大量擴(kuò)增備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
　　 (5)RT-PCR與ELISA檢測顯示：正義組VEGFmRNA與對照組比較，表達(dá)明顯增強(qiáng)，反義組表達(dá)顯著減弱，空載體組表達(dá)無明顯差異。VEGF蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與對照組相比，正義組VEGF表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，反義組VEGF表達(dá)顯著降低(P＜0.05

5、)，空載體組表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。
　　 (6)MTT結(jié)果顯示，細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下4組細(xì)胞體外生長曲線無明顯差異。
　　 【結(jié)論】(1)體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞對外源性VEGF165基因有較好的接受性，并獲得經(jīng)G418篩選的成纖維細(xì)胞陽性克隆。
　　 (2)正義VEGF基因轉(zhuǎn)染可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA和VEGF分泌蛋白的表達(dá)，反義VEGF基因轉(zhuǎn)染可減少VEGFmRNA的表達(dá)及蛋白的分泌，