馬傳染性貧血病毒基因轉(zhuǎn)移載體的優(yōu)化和改造.pdf

1、馬傳染性貧血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)是一種非靈長(zhǎng)類慢病毒，而且是基因組結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的慢病毒，可以將前病毒基因組持久地整合到感染細(xì)胞的染色體上并在感染細(xì)胞和子代細(xì)胞中表達(dá)病毒基因，可作為將外源基因引入細(xì)胞的載體。 孫成群利用我國(guó)EIAV的研究成果，在中國(guó)EIAV驢白細(xì)胞弱毒疫苗株(EIAV-DLA)感染性克隆(pOK8266)的基礎(chǔ)上，采用反向遺傳學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了包括EIAV載體質(zhì)

2、粒、EIAV-gag/pol/rev包裝質(zhì)粒和VSV-G囊膜表達(dá)質(zhì)粒的EIAV三質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)。 本研究是孫成群開(kāi)發(fā)的中國(guó)EIAV三質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)移載體系統(tǒng)的繼續(xù)，將對(duì)其進(jìn)行一系列優(yōu)化和改造，主要目的在于進(jìn)一步提高EIAV基因轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)基因效率，同時(shí)為四質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)移載體系統(tǒng)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 1．利用土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)對(duì)EIAV基因轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒進(jìn)行修飾，構(gòu)建了WPRE正向插入p

3、cPPTPRE(+)的EIAV載體質(zhì)粒pcPPTWPRE。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，在體外傳代細(xì)胞系HEK293中，WPRE可以顯著提高EIAV基因轉(zhuǎn)移載體的外源蛋白表達(dá)能力；而在DF-1細(xì)胞中，載體pcPPTWPRE表達(dá)外源蛋白的能力略高于pcPPTPRE(+)，雖然兩者的表達(dá)量均不高。 2．利用雜合啟動(dòng)子人巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG啟動(dòng)子)構(gòu)建EIAV基因轉(zhuǎn)移載體。PCR擴(kuò)增CAG核心啟動(dòng)子(不含雞β-肌動(dòng)蛋

4、白第一內(nèi)含子)，將其替換EIAV載體質(zhì)粒pcPPTWPRE中的內(nèi)部啟動(dòng)子人巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(CMVIE啟動(dòng)子)構(gòu)建了EIAV載體質(zhì)粒pcPPTEIACAGp。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,CAG核心啟動(dòng)子在雞體外培養(yǎng)細(xì)胞DF-1中啟動(dòng)外源基因表達(dá)的能力明顯高于CMVIE啟動(dòng)子；而在HEK293細(xì)胞中，兩者啟動(dòng)外源基因表達(dá)的能力相當(dāng)。 3．在CAG啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，利用酶切的方式分別構(gòu)建了含部分雞β-肌動(dòng)蛋白第一內(nèi)含子的EIAV

5、載體質(zhì)粒pWCAGP0.8和含全長(zhǎng)內(nèi)含子的EIAV載體質(zhì)粒pWCAGP1.6，研究雞β-肌動(dòng)蛋白第一內(nèi)含子對(duì)EIAV基因轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒外源蛋白表達(dá)能力的影響。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不含內(nèi)含子的EIAV載體質(zhì)粒pcPPTEIACAGp表達(dá)外源蛋白的能力優(yōu)于含部分或全長(zhǎng)內(nèi)含子的載體pWCAGP0.8和pWCAGP1.6，雞β-肌動(dòng)蛋白第一內(nèi)含子并沒(méi)有提高EIAV載體質(zhì)粒的外源蛋白表達(dá)能力，反而降低了其表達(dá)水平。 4．PCR．?dāng)U增rev

6、反應(yīng)元件RRE序列和EIAV 5′端R-U5序列，將其依次亞克隆入EIAV蛋白表達(dá)載體pCDGP中，借此研究RRE序列和5′端R-U5區(qū)對(duì)EIAV結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的影響。體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，EIAV-DLA基因組5、端的R區(qū)和U5區(qū)對(duì)EIAV結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄起決定性作用；Rev蛋白及其反應(yīng)元件RRE序列對(duì)gag/pol蛋白表達(dá)載體的表達(dá)是必不可少的。改造之后的gag/pol表達(dá)載體pSRU5GPR與rev表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293，IFA檢測(cè)獲