miRNA-HNF1α調(diào)控軸在肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝損傷是各種肝病共同的病理基礎(chǔ)。目前研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是肝損傷和肝病慢性化至關(guān)重要的因素。肝細(xì)胞是肝臟最主要的細(xì)胞成分。急、慢性肝損傷的炎癥反應(yīng)及修復(fù)過程中均有肝細(xì)胞參與。另外，肝細(xì)胞表面存在許多炎癥因子的受體，如白介素(Interleukin)受體、腫瘤壞死因子α(TNF-α)受體和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)受體等，表明肝細(xì)胞在肝臟的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　 肝細(xì)胞核因子(hepatoc

2、yte nuclear factors，HNFs)是一系列在肝臟中優(yōu)勢表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。其中，肝細(xì)胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor1α，HNF1α)是肝細(xì)胞核因子家族(HNFs)的主要成員之一。它可促進(jìn)肝細(xì)胞分化，在肝臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并在分化成熟的肝細(xì)胞中高表達(dá)，維持肝細(xì)胞的生物學(xué)功能。既往研究表明，肝臟發(fā)生急性炎癥時(shí)，HNF1α可通過促進(jìn)C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)的

3、表達(dá)參與肝臟急性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及修復(fù)。此外，炎癥因子白介素-6（interlukin-6，IL-6）可顯著抑制肝臟HNF1α的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄激活活性，提示HNF1α可能參與調(diào)節(jié)肝臟的炎癥反應(yīng)及肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛分布于線蟲、果蠅和人類多種組織細(xì)胞內(nèi)，是一類含21-25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA。miRNA可通過靶向結(jié)合于mRNA的3'非翻譯區(qū)，負(fù)向調(diào)控相應(yīng)的蛋白表達(dá)。既往有諸多

4、研究表明miRNA與炎癥關(guān)系密切。它們主要通過靶向作用于炎癥相關(guān)通路如NF-κB和JAK-STAT等通路上的重要蛋白起到促進(jìn)或抑制炎癥反應(yīng)的作用。miR-21是目前研究較多的炎癥相關(guān)的miRNA之一。既往有研究報(bào)道m(xù)iR-21可靶向作用于HNF家族的重要成員HNF4α，而我們的前期研究表明HNF4α在肝纖維化過程中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制肝纖維化進(jìn)展。以上研究提示炎癥相關(guān)的miRNA可能與HNF1α在肝纖維化炎癥反應(yīng)過程的作用有關(guān)。<

5、br>　　 基于以上研究背景，本研究旨在探明肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中HNF1α表達(dá)的變化，以及其表達(dá)變化對(duì)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，并進(jìn)一步探討HNF1α表達(dá)下調(diào)過程中miRNA可能發(fā)揮的作用，確定炎癥相關(guān)miRNA-HNF1α調(diào)控軸在肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，為慢性肝病的防治提供新的思路及策略。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 一、肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中HNF1α表達(dá)情況
　　 （一）原代肝細(xì)胞培養(yǎng)過程中HNF1α及炎癥因子表

6、達(dá)的變化
　　 分離正常SD大鼠原代肝細(xì)胞并體外培養(yǎng)，收取第1、3、5、7天細(xì)胞RNA及蛋白，Real-time PCR檢測TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)，Western Blot檢測各組HNF1α蛋白表達(dá)。
　　 （二）DMN模型大鼠原代肝細(xì)胞中HNF1α及炎癥因子表達(dá)變化
　　 雄性SD大鼠，予1％二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）溶液(100μl/100g)腹腔注射，每周注射

7、3次，共注射2周，觀察動(dòng)物狀態(tài)。改良后的Seglen兩步膠原酶灌注法分離DMN造模第0及第2周大鼠原代肝細(xì)胞，Real-time PCR、WesternBlot檢測肝細(xì)胞中HNF1α及炎癥因子的表達(dá)。
　　 二、構(gòu)建重組復(fù)制缺陷型腺病毒AdshHNF1α
　　 參照本實(shí)驗(yàn)室既往腺病毒構(gòu)建方法，構(gòu)建針對(duì)HNF1α的小干擾RNA表達(dá)載體(AdshHNF1α)。將AdshHNF1α體外感染大鼠原代肝細(xì)胞，Real-time P

8、CR和WesternBlot法檢測HNF1α表達(dá)，驗(yàn)證病毒構(gòu)建是否成功。
　　 三、下調(diào)HNF1α表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
　　 （一）HNF1α表達(dá)下降在體外對(duì)肝細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響分離正常SD大鼠原代肝細(xì)胞并體外培養(yǎng)，24 h后以感染復(fù)數(shù)(Multiplicity ofinfection，MOI)10感染AdshHNF1α，Western Blot檢測第12h、24h、36h肝細(xì)胞中HNF1α表達(dá)情況，Real-

9、time PCR檢測炎癥因子表達(dá)水平。
　　 （二）HNF1α表達(dá)下降在體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響
　　 正常SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射AdshHNF1α或?qū)φ詹《続dshNC，2×109空斑形成單位(Plaque forming units，Pfu)/只，每周2次，注射3周后處死，留取肝臟組織，抽提肝組織RNA，利用Real-time PCR檢測IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。利用免疫組織化學(xué)方法檢測肝細(xì)胞內(nèi)HNF1α表

10、達(dá)情況。
　　 四、miRNA-HNF1α調(diào)控軸對(duì)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控
　　 （一）炎癥相關(guān)miRNA對(duì)HNF1α表達(dá)的影響
　　 通過軟件預(yù)測篩選與HNF1α3'非翻譯區(qū)(3'untranslated region，YUTR)有結(jié)合位點(diǎn)的炎癥相關(guān)miRNA。同上法分離原代大鼠肝細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，利用lipo2000分別轉(zhuǎn)染miR-21、miR-31和miR-146a的擬似物(miRNA mimic)，48小時(shí)后

11、收集細(xì)胞，抽提RNA及蛋白，Real-time PCR檢測HNF1α mRNA表達(dá)，Western Blot檢測HNF1α蛋白表達(dá)。
　　 （二）驗(yàn)證HNF1α為炎癥相關(guān)miRNA的靶基因
　　 構(gòu)建HNF1α3'UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。利用lipo2000共轉(zhuǎn)染miR-21mimic或miR-146α mimic和熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，雙報(bào)告基因檢測試劑盒檢測報(bào)告基因活性，驗(yàn)證HNF1α是否為miR-21和miR-

12、146a靶基因。
　　 （三）炎癥因子刺激對(duì)炎癥相關(guān)miRNA及HNF1α表達(dá)的影響
　　 分離SD大鼠原代肝細(xì)胞，全血清培養(yǎng)2d后，換成含有50 ng/ml IL-6或20 ng/mlTNF-α的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);抽取48 h后細(xì)胞的總RNA和蛋白。Western blot法檢測HNF1α表達(dá)，Real-time PCR檢測HNF1α及miR-21、miR-146a的表達(dá)情況。
　　 （四）DMN、BDL模

13、型大鼠中HNF1α、miR-21和miR-146a表達(dá)的相關(guān)性
　　 參照本實(shí)驗(yàn)室方法制備膽總管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)和二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)大鼠肝纖維化模型。分別于注射DMN及行BDL術(shù)2周后處死大鼠，抽提肝臟組織RNA。Real-time PCR檢測肝組織中HNF1α、miR-21和miR-146a的表達(dá)，評(píng)價(jià)其表達(dá)相關(guān)性。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析<

14、br>　　 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，方差齊性采用t檢驗(yàn)，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn);P＜0.05為具有顯著性差異，JP＜0.01為具有非常顯著性差異。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 一、肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中HNF1α表達(dá)下降
　　 （一）原代肝細(xì)胞培養(yǎng)過程中HNF1α表達(dá)逐漸下降，炎癥因子表達(dá)上升
　　 大鼠原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，

15、HNF1α表達(dá)逐漸下降，而炎癥因子IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)逐漸升高。
　　 （二）DMN模型大鼠原代肝細(xì)胞中HNF1α表達(dá)下降，炎癥因子表達(dá)上升
　　 大鼠腹腔注射DMN造模成功后，分離DMN造模第0及第2周大鼠原代肝細(xì)胞，抽提RNA及蛋白，結(jié)果顯示與正常大鼠肝細(xì)胞相比，DMN造模第2周肝細(xì)胞中HNF1α mRNA及蛋白水平顯著下降，IL-6、TNF-α細(xì)胞因子mRNA水平明顯上升(P＜0.05)。
　　

16、 二、下調(diào)HNF1α表達(dá)在體內(nèi)外均可誘發(fā)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　 （一）HNF1α表達(dá)下降在體外對(duì)肝細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響
　　 分離正常SD大鼠原代肝細(xì)胞并體外培養(yǎng)，24 h后以MOI10感染AdshHNF1α，Westem Blot檢測第12h、24h、36h肝細(xì)胞中HNF1α表達(dá)情況，Real-time PCR檢測炎癥因子表達(dá)水平。結(jié)果顯示與AdshNC相比，AdshHNF1α可顯著下調(diào)肝細(xì)胞中HNF1α表達(dá)，上調(diào)肝

17、細(xì)胞中IL-6、TNF-α的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 （二）HNF1α表達(dá)下降在體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響
　　 正常SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射AdshHNF1α2周后處死，留取肝臟組織。免疫組化結(jié)果顯示注射AdshHNF1α后，肝組織內(nèi)HNF1α表達(dá)顯著降低。Real-time PCR結(jié)果顯示與AdshNC組相比，AdshHNF1α組IL-6及TNF-α表達(dá)顯著升高。
　　 三、miRNA-HNF1α調(diào)控軸在

18、肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用
　　 （一）炎癥相關(guān)miRNA可下調(diào)HNF1α表達(dá)
　　 查閱文獻(xiàn)中與炎癥相關(guān)的miRNA，利用軟件預(yù)測篩選其中與HNF1α3，UTR有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA，確定下一步繼續(xù)研究的miRNA為miR-21、miR-31和miR-146a。分離原代大鼠肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-21、miR-31和miR-146a的擬似物(miRNA mimic)，48小時(shí)后收取細(xì)胞RNA及蛋白，檢測HNF1α的mRNA及蛋

19、白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-21和miR-146a可顯著下調(diào)HNF1α mRNA及蛋白表達(dá)。
　　 （二）驗(yàn)證HNF1α為炎癥相關(guān)miRNA的靶基因
　　 293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-21 mimic或miR-146a mimic和HNF1α3'UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示miR-21 mimic和miR-146a mimic均可使報(bào)告基因活性顯著下調(diào)，提示HN1α為miR-21和miR-146a靶基

20、因。
　　 （三）炎癥因子刺激肝細(xì)胞后炎癥相關(guān)性miRNA表達(dá)升高，HNF1α表達(dá)下降
　　 分離SD大鼠原代肝細(xì)胞，全血清培養(yǎng)2d后，換成含有50 ng/ml IL-6或20 ng/mlTNF-α的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);于48 h收集細(xì)胞RNA及蛋白。Western blot法檢測HNF1α表達(dá)，Real-time PCR檢測HNF1α及miR-21、miR-146α的表達(dá)情況。結(jié)果顯示經(jīng)IL-6及TNF-α分別刺激后

21、，肝細(xì)胞中HNF1α蛋白表達(dá)下降，IL-6及TNF-α中和抗體可部分回復(fù)HNF1α蛋白表達(dá)。同時(shí)Real-time PCR結(jié)果提示，IL-6和TNF-α刺激后，肝細(xì)胞中miR-21和miR-146a表達(dá)升高，HNF1α表達(dá)下降。
　　 （四）DMN、BDL模型大鼠肝臟中miR-21、miR-146a和HNF1α表達(dá)的相關(guān)性
　　 分別于注射DMN及行BDL術(shù)2周后處死大鼠，收取肝臟組織RNA。Real-timePCR及相