SEPT9基因過(guò)表達(dá)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建SEPT9基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染惰性轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株HepG2，研究SEPT9基因過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲轉(zhuǎn)移的影響，探討SEPT9在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為SEPT9成為肝癌侵襲轉(zhuǎn)移新的生物學(xué)指標(biāo)及基因治療靶點(diǎn)提供更充分的依據(jù)。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種于6孔板，接種后24h內(nèi)將SEPT9基因真核表達(dá)載體pIRES2/EGFP-SEPT9轉(zhuǎn)染He

2、pG2細(xì)胞。設(shè)過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES2/EGFP-SEPT9）、空質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pIRES2/EGFP）和空白組（不加任何特殊試劑正常培養(yǎng)）。各孔HepG2細(xì)胞中加入脂質(zhì)體LipofectamineTM200010μl+DNA4μg混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。①轉(zhuǎn)染后48h，熒光顯微鏡下觀察帶有EGFP的細(xì)胞所占比例，判斷轉(zhuǎn)染效率。②轉(zhuǎn)染后72h，細(xì)胞裂解法提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，脫

3、脂奶粉封閉，一抗、二抗雜交孵育，化學(xué)發(fā)光液顯影，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)自動(dòng)曝光，凝膠成像儀掃描Image J2X軟件分析，檢測(cè)各組細(xì)胞中SEPT9蛋白相對(duì)于內(nèi)參蛋白GAPDH的表達(dá)量。③以轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h為時(shí)間點(diǎn)，CCK-8法檢測(cè)SEPT9基因過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。④轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力變化。⑤轉(zhuǎn)染后48h Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞侵襲

4、性及轉(zhuǎn)移性。
　　結(jié)果:①轉(zhuǎn)染后48h，綠色熒光細(xì)胞所占比率判斷出轉(zhuǎn)染效率約達(dá)70％。②western blot法分析顯示:過(guò)表達(dá)組SEPT9蛋白條帶亮度明顯強(qiáng)于兩對(duì)照組。定量分析顯示，空白組、空質(zhì)粒組、過(guò)表達(dá)組SEPT9蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.7078±0.018、0.7136±0.012、1.0526±0.020。經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)方差分析，過(guò)表達(dá)組SEPT9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別與兩對(duì)照組相比，約上升了48％左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

5、義(P＜0.05)。③CCK-8法結(jié)果顯示:與兩對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組HepG2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24～72h內(nèi)增殖速度增快，48h達(dá)到21.726％，72h達(dá)到30.164％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。④細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，24～72h過(guò)表達(dá)組劃痕寬度變化快，相比兩對(duì)照組，劃痕出現(xiàn)了明顯愈合趨勢(shì)。軟件測(cè)量并計(jì)算各時(shí)間段遷移距離，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移距離與兩對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑤侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示過(guò)表達(dá)組穿