己烯雌酚免疫分析化學研究.pdf

1、以己烯雌酚(DES)為研究對象，合成了半抗原己烯雌酚-單-羧基甲基-醚(DES-MCME)和己烯雌酚-單-羧基丙基-醚(DES-MCPE)，采用活性酯法和混合酸酐法將DES-MCME和DES-MCPE分別與牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)共價偶聯(lián)，制備了人工抗原DES-MCME-BSA和DES-MCPE-BSA，包被原DES-MCME-OVA(包被原Ⅰ)和DES-MCPE-OVA(包被原Ⅱ)。根據(jù)紫外掃描圖譜確定是否偶聯(lián)成功并

2、計算結合比，考察了反應物不同的摩爾比對最終偶聯(lián)物結合比的影響。結果表明，當采用活性酯法偶聯(lián)時，半抗原與BSA反應的投料摩爾比應在50∶1左右為宜，生成的偶聯(lián)物的結合比為10～30∶1。 分別以DES-MCME-BSA和DES-MCPE-BSA免疫新西蘭白兔制備抗血清。雙向瓊脂擴散法測定抗血清效價大于32∶1后采集全血，離心分離血清，并以硫酸銨分步鹽析分離抗血清中的抗體，冷凍干燥后-20℃保存。 以DES-MCME-BSA

3、為免疫原制備的抗體Ⅰ對己烯雌酚無親和力，而以DES-MCPE-BSA為免疫原制備的抗體Ⅱ對己烯雌酚具有特異性親和力。以包被原Ⅱ進行固相包被，成功建立了己烯雌酚間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法。方陣實驗確定了包被原Ⅱ的最佳包被濃度為1.5μg/ml，抗體Ⅱ的最佳工作濃度為1.5μg/ml。進一步研究了pH值、離子強度和有機溶劑含量對包被原Ⅱ和抗體Ⅱ的親和作用的影響以及己烯雌酚對包被原Ⅱ和抗體Ⅱ反應抑制率的影響。結果表明：較低pH的反應介質有利于

4、抗原抗體結合，pH6.6最佳。鹽濃度對抗原抗體結合反應影響較小，NaCl濃度等于0.15mol/L時最有利于競爭抑制反應，隨著鹽濃度的增高，抗原與抗體的結合率緩慢下降。低濃度的甲醇有利于包被原Ⅱ和抗體Ⅱ的結合反應，甲醇含量大于15％時抑制包被原Ⅱ和抗體Ⅱ的結合，隨著甲醇含量的增加，DES與抗體的親和力呈明顯的下降趨勢。在優(yōu)化條件下，建立了己烯雌酚對包被原Ⅱ和抗體Ⅱ結合反應的間接競爭ELISA標準抑制曲線，回歸方程為Ⅰ=21.00LogC

5、+47.44，r=0.9953，相對標準偏差RSD％=8.54％(n=5)。IC50=1.32ng/ml，IC20=0.05ng/ml。 在相同條件下，結構類似物雙酚A(BPA)對包被原Ⅱ和抗體Ⅱ結合反應的抑制曲線方程為Ⅰ=18.84LogC+31.214，r=0.9871。IC50=9.93μg/ml，抗體Ⅱ與雙酚A的交叉反應率為0.013％。 在豬肉中DES添加量為2ng/g，間接ELISA法測定的平均回收率為109