四種雞艾美球蟲ITS區(qū)序列分析及毒害與巨型或柔嫩艾美球蟲間在免疫上相互影響的研究.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由寄生于腸消化道上皮細(xì)胞的艾美屬(Eimeria)球蟲引起的一種對養(yǎng)雞業(yè)危害及其嚴(yán)重的寄生性原蟲病。其病原有堆型艾美球蟲(E.acervulina)、布氏艾美球蟲(E.brunetti)、巨型艾美球蟲(E.maxima)、和緩艾美球蟲(E.mitis)、毒害艾美球蟲(E.necatrix)、早熟艾美球蟲(E.praecox)和柔嫩艾美球蟲(E.tenella)等7個種，在臨床上常為幾種球蟲混合感染，因

2、此雞球蟲純種的分離與鑒定是開展雞球蟲生物學(xué)與分子生物學(xué)、免疫學(xué)與疫苗學(xué)等研究的基礎(chǔ)。為此，本研究采用單卵囊分離技術(shù)，分別建立了早熟艾美球蟲、和緩艾美球蟲、毒害艾美球蟲純種株，并對分離的3種球蟲與本室保存的4株巨型艾美球蟲的ITS全序列進(jìn)行了克隆與測序，在分子水平上對其進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定，并探討了不同種和同種不同株間球蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為雞艾美球蟲的鑒別診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。同時，本研究還探討了毒害艾美球蟲與巨型艾美球蟲或柔嫩艾

3、美球蟲間在免疫上的相互影響，旨在為今后雞球蟲病的免疫預(yù)防奠定基礎(chǔ)。
　　 1、早熟艾美球蟲、和緩艾美球蟲的分離與鑒定
　　 采用單卵囊分離技術(shù)，獲得了2株純種球蟲，鑒定為和緩艾美球蟲與早熟艾美球蟲。主要鑒定指標(biāo)：和緩艾美球蟲：卵囊呈球形或亞球型，囊壁光滑無色，卵囊內(nèi)有1極體，無內(nèi)、外殘余體；測100個卵囊的平均大小為(14.96±1.38)μm×(13.65±1.20)μm，測100個孢子囊的平均大小為(9.23±1.2

4、0)μm×(5.29±0.53)μm；潛在期96 h，最短孢子化時間15.5 h；蟲體主要寄生于小腸下段。早熟艾美球蟲：卵囊呈橢圓形或卵圓形，有極體，無內(nèi)、外殘余體；測100個卵囊的平均大小為(19.21±2.10)μm×(16.40±1.75)μm，測100個孢子囊的平均大小為(10.62±0.90)μm×(6.85±0.75)±μm；潛在期84 h，最短孢子化時間20 h；蟲體主要寄生于雞十二指腸與空腸前段。分別用此2株純種球蟲的孢

5、子化卵囊20×104、60×104個感染30日齡黃羽肉雞各10只，另設(shè)1個不感染對照組，結(jié)果感染2株純種球蟲的雞均未發(fā)生死亡，但平均增重與不感染對照組差異顯著(P<0.05)，感染和緩艾美球蟲的2組雞腸道均出現(xiàn)可見病變，感染早熟艾美球蟲的2組雞腸道病變記分為零。
　　 2、毒害艾美球蟲的分離與鑒定
　　 采用單卵囊分離技術(shù)從田間樣本分離到一株純種艾美球蟲，經(jīng)鑒定為毒害艾美球蟲。該球蟲卵囊呈長卵圓形，囊壁光滑，卵囊內(nèi)有一極

6、體，無卵膜孔和卵囊殘?bào)w；測100個卵囊大小(12.25～25.00)μm×(12.50～30.00)μm，平均大小(16.53±3.12)μm×(18.76±3.44)μm，形狀指數(shù)1.14；孢子囊呈長卵圓形，壁上含有一斯氏體，但無孢子囊殘?bào)w；測100個孢子囊大小(4.00～7.10)μm×(9.00～14.00)μm，平均大小(5.91±0.68)μm×(10.91±0.91)μm；測50個第二代裂殖體大小(32.50～75.00)μ

7、m×(28.00～62.50)μm，平均大小(50.77±11.77)μm×(44.44±9.51)μm；測25個裂殖子大小(1.50～3.00)μm×(9.50～12.50)μm，平均大小(2.41±0.27)μm×(10.51±0.93)μm；潛在期為145 h；最短孢子化時間19 h；卵囊主要寄生于盲腸。用純種球蟲的孢子化卵囊，以0.5×104、1×104、5×104的劑量分別感染30日齡黃羽肉雞各10只，并設(shè)置批內(nèi)重復(fù)，另設(shè)一不

8、感染對照組。結(jié)果顯示感染1×104組和5×104組雞出現(xiàn)死亡，其中5×104感染組死亡率為30％～40％，感染1×104組的死亡率為0％～10％；感染0.5×104組和1×104組平均增重與不感染對照組之間無顯著差異，感染5×104組平均增重與不感染對照組相比差異極顯著(P<0.05)。感染組雞腸道均出現(xiàn)病變，以感染5×104組最高。
　　 3、早熟艾美球蟲、和緩艾美球蟲、毒害艾美球及4株巨型艾美球蟲蟲ITS全序列克隆與序列分析

9、
　　 為進(jìn)一步從分子水平上確認(rèn)單卵囊分離所得的早熟艾美球蟲、和緩艾美球蟲、毒害艾美球蟲及本實(shí)驗(yàn)室分離保存的4株巨型艾美球蟲為純種艾美球蟲，以及探討這些球蟲分離株間的親緣關(guān)系，設(shè)計(jì)了1對種屬特異性引物，對上述4種7株球蟲的ITS全序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測序，并與GenBank中所登錄的相應(yīng)蟲種的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：早熟艾美球蟲擴(kuò)增片段大小為1084 bp、和緩艾美球蟲擴(kuò)增片段大小為1037 bp、毒害艾

10、美球蟲擴(kuò)增片段大小為1.337 bp、巨型艾美球蟲揚(yáng)州株擴(kuò)增片段大小為980 bp、巨型艾美球蟲上海株擴(kuò)增片段大小為875 bp、巨型艾美球蟲美國疫苗株擴(kuò)增片段大小為876 bp、巨型艾美球蟲南通株擴(kuò)增片段大小為1008 bp。幾種球蟲之間的同源性在50.8％～99.1％之間，平均遺傳距離為0.49。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中顯示各種球蟲分別與GenBank中下載的對應(yīng)蟲種處在同一分支上；在4株巨型艾美球蟲間，上海株與美國疫苗株形成一個分

11、支，序列間相似性為96.9％，揚(yáng)州株和南通株處于另一大的分支上，序列間相似性為99.1％。和緩艾美球蟲與序列號為FJ230365的和緩艾美球蟲一起處于最小分支，毒害艾美球蟲與各柔嫩艾美球蟲參考株一起形成一個大的支系，早熟艾美球蟲則單獨(dú)形成一個分支與其它各大的分支并列。
　　 4、毒害艾美球蟲與巨型艾美球蟲或柔嫩艾美球蟲間在免疫上的相互影響
　　 以黃羽肉雞為試驗(yàn)動物，分別以死亡率、腸道病變記分、平均增重、相對增重率、相對

12、卵囊產(chǎn)量、抗體水平等為評價(jià)指標(biāo)，分別探討了毒害艾美球蟲與巨型艾美球蟲(兩者在裂殖生殖階寄生部位相同)、毒害艾美球蟲與柔嫩艾美球蟲(兩者在配子生殖階段寄生部位相同)間在免疫上的相互影響。結(jié)果顯示：巨型艾美球蟲與毒害艾美球蟲混合免疫，免疫保護(hù)效果較毒害艾美球蟲單獨(dú)免疫的要高，顯示巨型艾美球蟲對毒害艾美球蟲的免疫有一定的協(xié)同效應(yīng)；而毒害艾美球蟲對巨型艾美球蟲的免疫有一定的負(fù)面影響，但不顯著。柔嫩艾美球蟲與毒害艾美球蟲混合免疫與毒害艾美球蟲單獨(dú)