草莓鑲脈病毒中國分離物全基因組結(jié)構(gòu)特征及其ORFVI基因功能鑒定.pdf

1、本研究測定了草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）中國分離物的全基因組序列，并依據(jù)SVBV美國分離物序列中各ORF的特征，確定了SVBV中國分離物編碼的6個ORF在其基因組中的準確位置。進一步根據(jù)SVBV中國分離物全序列克隆了6個ORF的完整序列，為后續(xù)SVBV功能基因研究提供了必需的序列資源。本研究還將SVBV中國分離物中的致病因子ORF VI轉(zhuǎn)入擬南芥，觀察ORF VI對擬南芥癥狀表型的

2、影響。
　　 1．SVBV中國分離物全基因組序列的測定及其序列分析
　　 用CTAB 法從已感染SVBV中國分離物的草莓葉片中提取總DNA，根據(jù)SVBV 美國分離物已知序列，設計特異性引物分段擴增了SVBV中國分離物全基因組各部分片段，克隆并測序，序列拼接獲得SVBV中國分離物全長基因組，基因組長7838 bp。將其與花椰菜花葉病毒屬其他成員以及SVBV 美國分離物進行序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SVBV中國分離物與SVBV 美

3、國分離物相似性最高，達86.14％。再根據(jù)SVBV 美國分離物各ORF 特征，進一步確定了SVBV中國分離物6個ORF在其基因組中的準確位置，將其與花椰菜花葉病毒屬其他成員對應的各個ORF 進行序列比對，并構(gòu)建了各ORF的系統(tǒng)關系樹。
　　 2．SVBV中國分離物各個ORF的克隆
　　 根據(jù)拼接的SVBV中國分離物全基因組序列，在其編碼的各個ORF 上下游設計特異性引物，分別擴增SVBV中國分離物各ORF的完整片段，克隆

4、并測序，和拼接的SVBV中國分離物基因組序列比較并校對，保存測序正確的各ORF 克隆。
　　 3．ORF VI 植物表達載體的構(gòu)建及以根癌土壤桿菌介導轉(zhuǎn)化擬南芥
　　 將SVBV中國分離物ORF VI插入植物表達載體pCAM2300，構(gòu)建重組植物表達載體pCAM P6。pCAM P6以根癌土壤桿菌介導轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)抗性篩選，獲得T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。癥狀觀察發(fā)現(xiàn)ORF IV轉(zhuǎn)基因擬南芥癥狀表型與非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株無明顯